Rôle de l'Exon Junction Complex dans la méthylation des ARNm – m6EJC

N6-méthyladénosine (m6A) est le nucléotide modifié le plus abondant des ARNm, jouant un rôle crucial dans la régulation de leur destin. Des défauts dans la méthylation m6A des ARNm sont associés à diverses pathologies. La m6A est déposée sur les transcrits naissants par METTL3, la sous-unité enzymatique du complexe multiprotéique MTC (MethylTransferase Complex). Cependant, les mécanismes régissant le ciblage du MTC vers des ARNm spécifiques ainsi que la distribution non uniforme des m6A le long des transcrits restent mal compris. Les EJCs (Exon Junction Complex), qui sont déposés lors de l’épissage, sont présents en plusieurs copies par ARNm. Les EJCs sont des éléments clés de l’architecture des particules mRNP hautement compactées dans le noyau. Des études récentes suggèrent que les EJCs contribuent à l’exclusion de la méthylation m6A dans certaines régions des transcrits. Nos résultats préliminaires indiquent désormais que les EJCs pourraient servir de points d’ancrage pour certaines sous-unités du MTC sur les transcrits, suggérant un rôle inédit des EJCs dans la méthylation des ARNm.
Nous formulons l’hypothèse que la méthylation des ARNm par le MTC a lieu suite à l’empaquetage des particules mRNP dépendant des EJCs, qui se produit de manière co-transcriptionnelle. Le recrutement direct des facteurs du MTC par des EJCs spécifiques accessibles au sein des mRNPs compactes pourrait potentiellement expliquer la distribution inégale des m6A dictée par l'architecture des gènes. Cette hypothèse soulève plusieurs questions clés : (i) Les EJCs recrutent-ils l’ensemble du MTC ? (ii) Les EJCs guident-ils le MTC vers des transcrits et des sites de méthylation spécifiques ? (iii) À quel stade de la maturation des ARNm les facteurs du MTC interagissent-ils avec les EJCs ?
Pour répondre à ces questions, nous proposons un projet structuré autour de quatre objectifs majeurs : Des données préliminaires indiquent que le facteur du MTC, RBM15, interagit directement avec l’EJC in vitro et in vivo. Premièrement, nous caractériserons la structure de ce complexe et validerons les domaines de liaison impliqués dans cette interaction (Objectif 1). Deuxièmement, après isolement du complexe EJC-MTC par ultracentrifugation, nous caractériserons ces complexes par co-immunoprécipitation, spectrométrie de masse et des approches structurales. Nous concevrons également des mutants ciblés pour perturber l’association EJC-MTC (Objectif 2). Troisièmement, nous réaliserons des analyses transcriptomiques pour identifier les transcrits associés au complexe EJC-MTC, cartographier les sites de liaison EJC-MTC dans le transcriptome et étudier leur rôle dans la modulation du dépôt de m6A (Objectif 3). Enfin, nous étudierons la cinétique de formation du complexe EJC-MTC in vivo et examinerons la dynamique d’assemblage du complexe EJC-MTC dans des cellules vivantes en relation avec la transcription par l’ARN polymérase II (Objectif 4).
Pour atteindre ces objectifs, les quatre partenaires, chacun apportant une expertise complémentaire, utiliseront des techniques de pointe, notamment des essais d’interaction biochimique, des analyses structurales, l’édition du génome, des approches à large échelle de transcriptomique et de protéomique, ainsi que de l’imagerie cellulaire avancée.