Décryptage des premières étapes de l'assemblage de la RNP H/ACA – HACA

Ce projet est consacré à l'étude de la biogenèse des diverses classes de RNP H/ACA (sno, sca et Télomèrase). Elles sont composées d'un ARN H/ACA s'associant à deux hétéro-tétramères de GAR1, NHP2, NOP10 et DKC1 (Psi-synthase) et sont impliquées dans plusieurs processus vitaux comme la formation de Psi dans les ARNr et UsnRNA ou la synthèse de télomères. La biogenèse de RNP H/ACA nécessite des protéines chaperon et des cofacteurs pour promouvoir l’assemblage, le repliement tertiaire et quaternaire: R2TP, SHQ1, NAF1 et DPCD. Le R2TP est une plateforme d'assemblage généraliste de complexes macromoléculaires. Il comprend RPAP3:PIH1D1 associé à un hétéro-hexamère de RUVBL1 et RUVBL2, qui sont des ATPases AAA+. La fonction du R2TP dans cet assemblage reste élusif.
Étant donné le large répertoire des RNP H/ACA avec de multiples fonctions vitales et que des défauts dans leur biogenèse sont liés à de nombreuses maladies, il est essentiel de comprendre comment cet assemblage est catalysé et régulé. Sur la base de nos données préliminaires, nous proposons que plusieurs complexes intermédiaires protéiques soient formés successivement au cours des premières étapes de l'assemblage des RNP H/ACA avant l'association avec les ARN.
Nous aborderons les questions suivantes: Quels sont les pré-complexes formés successivement avant l'interaction des protéines cœur avec l'ARN? Quelles sont leurs composition, stœchiométrie et structure 3D? Quelle est la fonction du R2TP dans le recrutement/libération de SHQ1 et l'importance de son activité ATPase? Quels sont les déterminants moléculaires de la spécificité du R2TP pour l'assemblage des RNP H/ACA et quelle est la fonction du DPCD?
Pour ce faire, nous utiliserons des techniques de pointe: (i) purification in vivo par IP des complexes cellulaires macromoléculaires, (ii) reconstitution in vitro de pré-complexes par co-expression, (iii) nMS et MP pour leur caractérisation et (iv) cryo-EM à particule unique pour la résolution de leur structure 3D