Réactions de Wittig pour la détection moléculaire fondée sur les aptamères – WEAPONS

Dans le domaine de la détection moléculaire, les sondes fluorescentes dont l'activation repose sur des processus non-réversibles de chimie covalente sont très prisées. En particulier, celles fondées sur le principe de l'assemblage covalent permettent de maximiser l'intensité de la réponse fluorogénique "OFF-ON" et ainsi d'abaisser drastiquement la limite de détection de l'analyte ciblé. Cette approche de rupture est basée sur l'utilisation de précurseurs moléculaires "cagés", qui sont convertis in situ en coeurs fluorescents via des réactions domino, efficaces dans les milieux aqueux et déclenchées par l'analyte. Elle a déjà été mise en oeuvre pour la détection in vitro de diverses substances, mais uniquement avec des fluorophores émettant en deçà de 550 nm (typiquement des coumarines). Afin de faciliter des analyses dans des milieux biologiques complexes, il y a un réel besoin d'étendre ce concept à des fluorophores émettant au-delà de la région vert-jaune du spectre visible. Ainsi, les chimistes (bio)organiciens ont un rôle à jouer en développant de nouvelles réactions fonctionnant dans ces matrices aqueuses. Le but du projet WEAPONS est d'appliquer le concept de l'assemblage covalent à la formation in situ de colorants cyanine, et plus précisément ceux dont la chaîne polyméthine possède 3 ou 5 atomes de carbones (cyanines de type Cy3 ou Cy5 permettant de couvrir la gamme spectrale 550-700 nm). L'originalité de notre approche est la mise au point d'une réaction de Wittig biocompatible entre deux précurseurs de type "demi-cyanine", fonctionnalisés respectivement par un ylure de phosphore stabilisé et un aldéhyde masqué par un motif enzymo-labile (typiquement, un motif auto-immolable de type N-acyl-N,O-acétal ou N,S-thioacétal). Il sera ainsi possible de déclencher cette réaction par ajout de l'enzyme ad hoc. Le programme scientifique du projet WEAPONS repose sur trois WPs complémentaires. Le premier ambitionne de valider cette nouvelle voie d'accès aux cyanines Cy3 et Cy5, en utilisant comme stimulus biologique, l'acylase de pénicilline G (PGA) et en mettant au point des synthèses versatiles des précurseurs "demi-cyanine". En effet, l'idée directrice est de pouvoir accéder ensuite à des partenaires réactionnels facilement conjugables à des séquences d'ADN dans le but de mettre en oeuvre cette réaction de Wittig fluorogénique sur matrice d'acide nucléique. Le déploiement d'une stratégie de type DTS ("DNA templated synthesis") est indispensable pour forcer le rapprochement spatial des deux partenaires de la réaction de Wittig, et ainsi favoriser ce processus bimoléculaire. Ainsi, dans le second WP, le partenaire 2 spécialiste de la chimie de ces biomolécules, validera une stratégie de double fonctionnalisation aux extrémités 3' et 5' d'oligonucléotides par une paire de précurseurs de la cyanine, bioconjugables et synthétisés par le partenaire 1 dans le cadre du premier WP. On capitalisera notamment sur deux réactions "click" déjà bien éprouvées : CuAAC et IEDDA. Une extension de ce schéma de bioconjugation à un oligonucléotide connu pour se structurer en épingle à cheveux, sera ensuite envisagée pour confirmer que la stratégie DTS favorise bien la formation in situ de la cyanine fluorescente. Le dernier WP sera dédié à une application en biodétection. Dans un premier temps, la mise en oeuvre de la réaction de Wittig enzymo-déclenchée et de la stratégie DTS avec un aptamère de 30 nucléotides (MNS-7.9) sélectionné pour reconnaître la cocaïne sera considérée. Les performances de détection de cet aptasenseur seront évaluées. Cette approche sera ensuite étendue à la détection multiplexe de 4 drogues illégales différentes : la cocaïne, le fentanyl, la méthamphétamine et le ?-9-tétrahydrocannabinol (?9-THC) en utilisant un jeu de 4 aptamères fluorogéniques, capables de produire des émissions de fluorescence distinctes via la formation in situ de 4 cyanines différentes.