Auto-assemblage des virus, du tube à essai au cytoplasme cellulaire – VISA

La plupart des virus ont pour génome non pas de l'ADN double brin (db), comme c'est le cas pour tous les autres organismes en évolution, mais plutôt de l'ARN simple brin (sb). En outre, l'ARNsb étant beaucoup plus compact et compressible que l'ADNdb, il est possible de fabriquer des particules virales à génome à ARNsb à partir de leurs composants purifiés, soit l'ARNsb et la protéine de capside, en mélangeant simplement ces composants dans une solution tampon physiologique. Chaque particule infectieuse est constituée d'une seule molécule d'ARN à l'intérieur d'une coque composée de centaines de copies de la protéine de capside. Ces résultats remarquables ont facilité un grand nombre d'études expérimentales et théoriques sur le processus d'auto-assemblage de nucléocapsides parfaitement ordonnées et de symétrie icosaédrique. Il est généralement admis que ce phénomène "en éprouvette"/in vitro imite la formation d'une nouvelle génération de particules virales dans leur cellule hôte, juste après la réplication de leur génome à ARNsb et de la synthèse d'un nombre de protéines de capside des centaines de fois supérieur. Mais, en réalité, il n'existe à ce jour pratiquement aucune étude expérimentale ou théorique visant à combler le fossé entre les bases de connaissances acquises à partir des études in vitro de l'auto-assemblage des virus d'une part et de la réplication virale intracellulaire d'autre part. Dans le présent projet, nous proposons une première série de mesures systématiques visant à connecter ces deux ensembles de phénomènes.

En particulier, notre hypothèse de travail est que la différence entre l’auto-assemblage in vitro et intracellulaire (cytoplasmique) des particules virales à partir de leur ARN et de leur protéine de capside est double : (1) dans le cytoplasme, ces composants de base sont intégrés dans une solution concentrée de protéines et d'acides nucléiques qui est très visqueuse et dont les effets osmotiques modifient les conformations et les interactions entre l'ARN viral et les protéines de capside ; et (2) dans le contexte cellulaire, les protéines de capside sont activement synthétisées, c'est-à-dire via consommation d'ATP, par la machinerie ribosomale, de sorte qu'un flux presque constant de protéines de capside entraîne le processus d'auto-assemblage du virus vers un état hors équilibre. Pour relier les contextes in vitro et cellulaires, nous proposons d'étendre nos mesures antérieures sur l'auto-assemblage de virus à partir d'ARN purifié et de protéine de capside : (1) en effectuant ces réactions en présence contrôlée d'osmolytes calibrés et en synthétisant la protéine de capside dans des extraits cytoplasmiques où l'ARN messager (m) est traduit en protéine de capside qui, à son tour, l’empaquète en nucléocapsides ; et (2) en suivant la production de protéines de capside et de nucléocapside directement dans des cellules vivantes. Ces processus seront étudiés et quantifiés à l'aide d'une combinaison de techniques expérimentales de pointe, notamment la RMN à l'état solide, la diffusion des rayons X résolue en temps sur synchrotron, la cryomicroscopie électronique à transmission et la microscopie de fluorescence à super-résolution, ainsi que la théorie analytique et les simulations numériques à gros grains. Tous ces travaux seront menés en parallèle pour un virus de mammifère et un virus de plante - le virus de l'hépatite B (HBV), qui possède un génome à ADN mais dont l'information génétique est empaquetée dans le cytoplasme sous forme d'ARNm, et le virus de la marbrure chlorotique de la cornille (CCMV), tous deux bien caractérisés par des études in vitro - afin de fournir pour la première fois une base générale pour la compréhension de l'auto-assemblage des virus dans l’environnement cellulaire.