Investigation approfondie des nitrogénases par l'étude de leurs asymétries, modèle hyperthermophile et biomimétiques semi-synthétiques – NITRO GENESE

Pour nourrir notre monde moderne de façon décarbonée, les technologies de fixation du diazote (N2) inspirées du monde microbien constituent un élément clé du développement de sources d’ammoniac (NH3) vert. La nitrogénase est centrale à ces approches, étant la seule enzyme capable d’activer le N2. Elle procède cependant via une réaction séquentielle complexe et coûteuse en énergie, dans laquelle 16 ATP sont nécessaires à la formation de deux NH3. La fixation du N2 par la nitrogénase implique une « protéine Fe » contenant un cluster Fe4S4 fournissant les électrons et un hétérotétramère, « protéine MoFe » qui héberge le cluster métallique P et le cofacteur FeMo du site actif. La complexité de ces métallocofacteurs et de cette séquence réactionnelle, se traduisent par de nombreuses questions ouvertes nécessaires à la compréhension de la fixation biologique de N2 : Comment la conformation et la coopérativité de la protéine MoFe affectent sa réactivité et la fixation de la protéine Fe ? Où se situe le site de fixation du N2 sur le cofacteur FeMo ? Comment la matrice protéique contribue-t-elle à la réaction ? Les réponses à ces questions permettront de contribuer au développement de catalyseurs bioinspirés ouvrant de nouvelles voies de synthèse de NH3.
Grâce à sa synergie unique entre la microbiologie, la biochimie, la biophysique, la bioinformatique et la chimie, NITRO GENESE ouvre de nouvelles perspectives pour répondre à ces questions par le biais d'approches non conventionnelles.
La coopérativité et les changements conformationnels au cours du cycle seront étudiés grâce à un modèle de protéines MoFe contenant un demi-site réactionnel. Grâce à une stratégie de double marquage, des chimères présentant un côté de l'hétérotétramère non-fonctionnel seront générées chez la bactérie modèle Azotobacter vinelandii. Les propriétés biochimiques des mutants de demi-sites seront caractérisées afin de comprendre la communication d´un centre actif à l'autre via une interaction à longue portée et ses implications sur le cycle réactionnel.
Pour élucider le site de fixation du N2 et les intermédiaires NxHy, le projet s’appuiera sur la récente découverte d'une nitrogénase hyperthermostable, inactive catalytiquement à température ambiante. L'étude de cette protéine MoFe provenant d’une archée trouvée à proximité de volcans sous-marin permettra d'observer l'enzyme en action. De plus, la caractérisation de la machinerie rudimentaire de synthèse du cofacteur FeMo de l'archée fournira des informations sur son évolution et ses réactions tout en permettant la génération de mimiques du cofacteur in vitro.
L'importance de l'environnement protéique sera étudiée à l'aide de catalyseurs semi-synthétiques. D’une part, une série d'analogues hydrosolubles du cofacteur FeMo seront synthétisés pour être incorporés dans les nitrogénases vides de la bactérie ou de l´archée et les propriétés catalytiques de ces assemblages seront étudiées. D’autre part, le cofacteur FeMo extrait et ses analogues synthétiques seront immobilisés pour promouvoir l'électro-réduction de N2, réaction prototype de l’utilisation de sites actifs bio-inspirées pour la conception d’éléctrocatalyseurs de synthèse de NH3.
La biologie structurale, la spectroscopie et la modélisation informatique sont les piliers de cette approche, étant essentielles pour caractériser les métallocofacteurs au sein de l’enzyme. Grâce à cette combinaison, NITRO GENESE réalisera le tour de force de révéler les chainons manquants de la fixation biologique de N2, des mouvements coopératifs observés au cours du cycle réactionnel à la description à l’échelle atomique de l’environnements de la cavité accueillant le site actif, tant lors de l’étape de liaison de N2 que celles des intermédiaires réactionnels. Les résultats attendus permettront d’ouvrir la voie à la conception de nouveaux systèmes bio- et électro-catalytiques, posant ainsi les fondements de l’élaboration de stratégies décarbonnées pour la production de NH3.