Caractérisation moléculaire et fonctionnelle des condensats formés par les protéines adaptatrices de TBK1 – ChaConAdapt

Les organites sans membrane et les condensats liquides contribuent à la compartimentation de la cellule. Ce sont des structures dynamiques capables de concentrer ou d’exclure des protéines spécifiques, grâce à la séparation de phase liquide-liquide (SPLL). Du fait de ces propriétés, les condensats sont impliqués dans un large éventail de processus cellulaires. Ainsi, de nombreuses protéines associées aux voies d'induction de l'interféron (IFN) forment des condensats.
Récemment, nous avons montré que les protéines adaptatrices NAP1/AZI2, SINTBAD/TBKBP1 et TANK forment des condensats dynamiques, mobiles dans le cytoplasme, capables de recruter TBK1 (la kinase phosphorylant les facteurs de transcription IRF3 et IRF7) en réponse à une infection par le virus de la rage ou à la détection d'ARN double brin (extra ou intracellulaire). Le rôle de ces condensats reste à étudier. Notre hypothèse est que la formation de condensats par les protéines adaptatrices de TBK1 constitue un nouveau niveau de régulation de l'induction de l'IFN, allant au-delà des modifications post-traductionnelles des protéines impliquées. En accord avec cette hypothèse, nous venons d’identifier des mutations du gène AZI2 chez des patients atteints de lupus érythémateux disséminé et d'interféronopathie idiopathique.
Les objectifs de ce projet sont (i) d'identifier les bases moléculaires permettant la formation des condensats des protéines adaptatrices, (ii) de déterminer le protéome de ces condensats, (iii) de caractériser leur dynamique, leurs fonctions dans l'immunité innée et leur implication dans des contextes pathologiques.
Tout d’abord, nous caractériserons les bases moléculaires de la formation des condensats de ces protéines adaptatrices. Nous avons établi des systèmes cellulaires minimaux qui seront précieux pour décrypter l'importance des différents domaines de ces protéines modulaires, enrichies en régions intrinsèquement désordonnées (fréquemment impliquées dans les SPLL). Nous étudierons aussi l'impact de TBK1 et/ou de son activité kinase sur la formation des condensats. Ensuite, en utilisant des lignées cellulaires dans lesquels les gènes d’intérêt ont été invalidés, nous déterminerons le rôle de ces condensats dans la voie d'induction de l'IFN et nous étudierons les déterminants moléculaires à l’origine des phénotypes observés chez les patients ayant des mutations dans le gène AZI2. Par ailleurs, les condensats étant très sensibles à leur environnement et par conséquent difficiles à purifier, nous caractériserons leur protéome par biotinylation de proximité suivie de l’identification des protéines par spectrométrie de masse. La localisation des protéines ainsi identifiées sera validée par microscopie confocale à l'aide d'anticorps commerciaux ou après transfection avec des plasmides permettant l'expression de protéines marquées ou fluorescentes. Leurs fonctions seront étudiées par des approches d’invalidation de gènes ou à l'aide de molécules spécifiques ciblant leur activité, lorsque celles-ci sont disponibles. Enfin, nous analyserons le rôle du cytosquelette dans leur mobilité à l'intérieur du cytoplasme.
Ce projet devrait mettre en évidence un nouveau niveau de régulation de l'induction de l'IFN par formation de condensats. Au-delà de l'immunité innée, il est fort probable que le type de régulation que nous identifierons soit utilisée dans d'autres voies de signalisation. Ce projet pourrait donc avoir des implications plus générales en mettant en avant un nouveau rôle des condensats en biologie cellulaire.