Dissection de l'isolation génomique à travers le prisme de la grammaire de liaison de la protéine CTCF – InsulatorGrammar

Les génomes des mammifères sont segmentés en Domaines Topologiquement Associés (TAD) qui limitent la formation de boucles Enhancer-Promoteur (E-P) et d’autres processus biologiques. Les TAD sont formés par extrusion de boucles médiée par la Cohésine, qui est ensuite bloquée aux frontières des TAD. La plupart des frontières des TAD lient la protéine CTCF, mais elles présentent également un enrichissement en G-quadruplexes (G4) et en sites d'initiation de la transcription. Nous avons récemment montré que les frontières de TAD présentent à la fois un regroupement de site de liaison CTCF (plusieurs pics ChIP-seq) et plusieurs motifs de liaison à l'ADN au sein de ces pics. Cette juxtaposition des motifs au sein des pics s’est révélée particulièrement bénéfique pour la liaison de CTCF aux motifs de faible affinité, suggérant que ce regroupement local pourrait favoriser des synergies de liaison. En utilisant Nano-C, une nouvelle approche 3C multi-contacts, nous avons montré que les frontières des TAD ne sont pas imperméables et que les pics CTCF contribuent individuellement (mais partiellement) au blocage de l'extrusion des boucles. Le regroupement des pics améliore ainsi l’efficacité capacité globale du blocage de l'extrusion de boucles, et favorise donc la séparation des TADs. Nous émettons l'hypothèse que le blocage de l'extrusion de boucles aux frontières des TAD est définies par une grammaire de liaison de CTCF, et que le positionnement des nucléosomes, la transcription et les G4 ont un impact supplémentaire. Cette grammaire, codée par l'ADN, fournirait un moyen flexible pour réguler la perméabilité des frontières des TAD, permettant ainsi d’affiner la formation des boucles E-P et la régulation des gènes.

Notre projet « InsulatorGrammar » vise à disséquer systématiquement comment la grammaire CTCF peut être utilisée pour réguler l’extrusion de boucles, permettant ainsi de moduler la formation des boucles E-P. Pour atteindre cet objectif, nous examinerons comment le regroupement local de motifs CTCF, codé par l’ADN, combiné à autres caractéristiques de la chromatine, crée des environnements chromatiniens favorables à la liaison de CTCF, et comment cette synergie affecte l’extrusion des boucles et le blocage des Enhancers.

D’abord, nous utiliserons des cellules permettant la dégradation et le rétablissement chronométrés de CTCF afin de déterminer comment la grammaire CTCF (nombre, orientation et affinité des motifs) ainsi que d’autres caractéristiques de la chromatine, influent sur sa liaison. Ensuite, nous intégrons 50 éléments isolateurs synthétiques « concepteurs » qui varient en fonction de la grammaire CTCF et de la présence, ou non, de transcription et de G4 à proximité. A l’aide d’un nouveau système rapporteur pour les boucles E-P, nous déterminerons pour toutes ces lignées, l’influence de cette grammaire CTCF sur la liaison de CTCF et sur le blocage des Enhancers. De plus, un tiers de ces lignées sera analysée à l’aide d’une stratégie combinant une approche multi-omique approfondie avec une modélisation biophysique afin de dévoiler les caractéristiques sous-jacentes de la chromatine. Ces études révéleront comment la grammaire du CTCF et des autres caractéristiques chromatiniennes affectent réciproquement la liaison de CTCF, le positionnement des nucléosomes et la formation des G4. Ces connaissances structurelles seront ensuite reliées à l'impact fonctionnel sur le blocage de l'extrusion de boucles, les boucles E-P et l'organisation des TAD.

Notre projet multidisciplinaire InsulatorGrammar générera une vision sans précédent comment le regroupement des sites CTCF peut agir en synergie avec d'autres caractéristiques de la chromatine pour assurer un réglage fin, codé par la séquence, des boucles E-P et de la régulation des gènes. Les résultats aideront à expliquer comment des changements plus subtils dans l’activité des gènes peuvent être introduits, avec des répercussions sur le développement, l’évolution et la maladie.