Nanoscopie quantitative à température cryogénique. – CryoQN

Le passage à température cryogénique est une étape clé dans l’évolution de la microscopie de fluorescence à super-résolution, afin de surmonter les artefacts résultant de la fixation chimique et de faciliter les études cryo-corrélatives. Pourtant, malgré des progrès significatifs ces dernières années, la cryo-nanoscopie et, en particulier, la cryo-SMLM, n'ont pas encore permis d'obtenir des images super-résolues de qualité suffisante. L'un des principaux obstacles est le comportement photophysique altéré des fluorophores, qui ne photo-commutent pas efficacement à basse température.

Ce projet concerne l'optimisation de la cryo-SMLM utilisant des protéines fluorescentes (FPs) comme marqueurs. Notre objectif est d'améliorer de manière significative la qualité des images cryo-SMLM obtenues avec des FPs en (i) étudiant les propriétés photophysiques et en réalisant l’ingénierie de plusieurs FPs à température cryogénique, (ii) modifiant un microscope cryo-SMLM et (iii) développant le pore nucléaire (NPC) comme outil de métrologie pour évaluer quantitativement la performance de la cryo-SMLM.

En (i), en utilisant d’abord rsEGFP2 et mEmerald, et grâce à une combinaison de cristallographie, microspectrophotométrie, RPE et imagerie de molécules uniques, nous étudierons la nature des états cryo-commutés, notamment le rôle de l'état triplet et d’états radicalaires. Pour améliorer la cryo-commutation, nous manipulerons ces états à l'aide de lumière UV et IR. Nous tenterons également d'améliorer la cryo-commutation de FPs cyan et rouges en vue de la cryo-SMLM multicolore.

En (ii), nous améliorerons la stabilité de notre microscope cryo-SMLM, sa capacité à collecter la lumière, et nous l’équiperons de lasers UV et IR.

En (iii), nous utiliserons le pore nucléaire et la méthode CRISPR-Cas9 pour évaluer quantitativement les performances de la cryo-SMLM avec nos FPs les plus performantes et en utilisant des stratégies optimisées de collecte et de traitement des données.

CryoQN permettra d'approfondir les connaissances sur les protéines fluorescentes et de réaliser des mesures quantitatives avec la cryo-nanoscopie.