Est ce que la quiescence cellulaire protège des LOH induites par CRISPR? – CRISPR-SAFE

La technologie CRISPR-Cas9 est une découverte qui a propulsé la médecine régénérative dans une nouvelle ère. Des progrès considérables ont été réalisés et plusieurs études cliniques utilisant la nucléase CRISPR-Cas9 sont déjà en cours. Néanmoins, une préoccupation majeure est la génotoxicité potentielle des cassures double brin de l'ADN (DSB), qui résulte d'une réparation incorrecte de l'ADN. Nous avons récemment rapporté que les événements indésirables sont plus perturbateurs que la seule induction d'insertions et de délétions (Indels) au locus ciblé (Cullot et al Nat com 2019, Boutin et al Nat com, 2021). Sur la base de résultats préliminaires nouveaux et robustes (Cullot et al en revision), nous émettons aujourd’hui l'hypothèse que la phase du cycle cellulaire au cours de laquelle le DSB se produit pourrait influencer le taux de perte d'hétérozygotie (LOH). Notre projet ANR va (i) renforcer les résultats préliminaires en établissant ex vivo une corrélation entre le ralentissement du cycle cellulaire et la diminution de l'apparition de LOH dans les cellules primaires utilisées pour les essais cliniques (cellules souches/progénitrices hématopoïétiques et lymphocytes T) (ii) déterminer les conditions de culture modulant le cycle cellulaire pour prévenir le risque de LOH (iii) développer un contrôle temporel de l'édition du génome de la nucléase CRISPR-Cas9 par le développement de nouvelles Cas-9 (iv) évaluer le risque de LOH in vivo dans les greffons hématopoïétiques. Pour répondre à ces questions, nous avons inventé deux nouveaux systèmes pour détecter facilement les LOH par cytométrie en flux. Les analyses seront complétées par un séquençage d'ARN unicellulaire dont l’analyse bioinformatique sera améliorée pour détecter tous les types de LOH (perte de matériel mais également copie neutre). Ce projet original est une étape clé dans la recherche de solutions pour augmenter la sécurité de la technologie CRISPR pour le développement de la médecine régénérative