Séquençage de novo d'anticorps circulants par protéomique top-down – AntiboTOP

Le développement de nouveaux anticorps thérapeutiques fait aujourd’hui l’objet d’une recherche intense. La découverte et l'ingénierie de ces biomédicaments nécessitent la caractérisation (séquence en acides aminés et modifications post traductionnelles, PTMs) d’anticorps endogènes, qui reste une tâche difficile. Des méthodes de séquençage génomique sont généralement utilisées, mais conduisent souvent à des erreurs ou des séquences partielles et sont longues à mettre en œuvre. En outre, elles ne permettent pas d’obtenir des informations sur les formes protéiques fonctionnelles des anticorps (protéoformes).
La spectrométrie de masse (MS) est ainsi devenue un outil de choix dans le domaine. L’analyse par LC-MS/MS des peptides générés par digestion enzymatique des anticorps est aujourd'hui la principale méthode d'analyse utilisée. Cette approche conduit à des informations sur la séquence et la localisation des PTMs, mais ne permet pas de s’intéresser aux protéoformes. Des approches alternatives et complémentaires ont donc émergé, soit sur les anticorps intacts (protéomique top-down), soit sur leurs sous-unités (protéomique middle-down). Cependant, aucune ne s'est avérée suffisamment efficace pour permettre une caractérisation complète de protéoformes endogènes. Par ailleurs, bien qu'il existe des outils bioinformatiques de séquençage de novo au niveau peptidique, aucun outil de ce type n'existe au niveau des protéoformes.
Dans ce contexte, l'objectif du projet AntiboTOP est de réaliser le séquençage de novo complet d'anticorps circulants spécifiques en utilisant des approches de protéomique top-down innovantes incluant de nouvelles méthodes pour le traitement et l'analyse des données. Deux spectromètres de masse uniques en France seront utilisés pour atteindre cet objectif : un Q-Exactive HF Orbitrap BioPharma équipé d'une Omnitrap et l'Orbitrap Tribrid Eclipse, qui est actuellement la plateforme commerciale la plus puissante en protéomique top-down. L'Omnitrap est un système original permettant l’utilisation d’un arsenal de techniques de manipulation (et fragmentation) des ions. En outre, l’Omnitrap-Orbitrap qui sera utilisé est équipée d'un système externe d'acquisition de données à haute performance (booster FTMS) donnant accès aux données brutes non réduites, ce qui permet de maximiser l'extraction et la qualité des informations obtenues. Pour améliorer les performances de l’Eclipse, nous prévoyons de l'équiper d'un booster FTMS de nouvelle génération.
Le projet est divisé en trois parties. La première, basée sur l’utilisation d’anticorps modèles, est dédiée à l'optimisation de tous les paramètres expérimentaux de LC-MS/MS, l'évaluation des besoins en matière de traitement/analyse des données, ainsi qu’à une comparaison des outils logiciels existants. Dans la deuxième partie, nous développerons les méthodes de traitement et d’analyse bio-informatique des données (ciblées ou non) afin d'optimiser la qualité des informations extraites des analyses LC-MS/MS. Un logiciel permettant le séquençage de novo de protéoformes, sera mis au point. Enfin, dans la dernière partie, nous utiliserons les méthodes optimisées précédemment pour réaliser le séquençage de protéoformes d’anticorps circulants immunopurifiés à partir du sérum de patients vaccinés ou guéris de la Covid-19.
AntiboTOP est un projet multidisciplinaire qui s'appuie sur la complémentarité et l'expertise uniques de l'unité MSBio (J. Chamot-Rooke) à l'Institut Pasteur (biologie, MS expérimentale) et d'une petite entreprise de deep-tech Spectrotech SAS à Lyon dirigée par Y. Tsybin (physique, traitement des données et algorithmes d'analyse). AntiboTOP rendra possible, pour la première fois, le séquençage de novo d'antigènes endogènes par MS. Il s'agit d'une avancée majeure avec un impact économique et industriel potentiel important. Les solutions développées seront largement diffusées et commercialisées auprès des laboratoires d'analyse publics et industriels.