Sondes moléculaires pour la caractérisation du transport lysosomal d'oligosaccharides – MOCALOST

Contexte. Les fragments d'oligosaccharides dérivés de pathogènes et de glycoconjugués de l'hôte peuvent être immunogènes. Chez les mammifères, les oligosaccharides libres (fOS) sont normalement produits dans le réticulum endoplasmique (RE) pendant la biosynthèse des N-glycoprotéines. Dans certains cas, ils deviennent pro-inflammatoires après une démannosylation partielle. On ignore comment et où ces fOS pro-inflammatoires (fOSp) sont démannosylés. On sait qu'après le transport des fOS du RE vers le cytoplasme, le transport des fOS du cytoplasme vers le lysosome (LOST : Lysosomal OligoSaccharide Transport) permet aux mannosidases lysosomales d'accéder aux fOS. Notre hypothèse est donc que LOST est impliqué dans la transformation des fOS en fOSp. Cette hypothèse est difficile à vérifier car LOST est une activité orpheline dont la (les) protéine(s)/gène(s) sous-jacente(s) n'a (n'ont) pas été identifiée(s).
Objectifs. Identifier les protéines LOST à l'aide de sondes de marquage par photoaffinité et de la protéomique quantitative. Après avoir identifié le(s) gène(s) codant(s), l'expression de LOST sera manipulée génétiquement dans les cellules afin de comprendre son rôle dans des conditions normales et pathologiques. Nous produirons aussi de nouvelles sondes fluorogènes adaptées au dosage en temps réel de LOST et à la visualisation de son action par microscopie en fluorescence. Données préliminaires. Nous avons démontré que les petits chitooligosaccharides (COS) et les fragments de peptidoglycane (PG) d'origine bactérienne contenant des sucres, qui constituent des cibles plus faciles à modifier chimiquement que les fOS, sont des inhibiteurs de LOST et que les petits COS sont probablement des substrats de LOST. La reconnaissance des substrats oligosaccharides par LOST nécessite qu’ils aient une extrémité réductrice intacte. Ainsi, les chimistes ont synthétisé des COS substitués au niveau de leur extrémité non réductrice et les biologistes ont montré qu’ils interagissent avec LOST et peuvent être transportés dans les lysosomes.
Méthodes. Sur la base de ces résultats, des sondes d'affinité photoactivables biotinylées à base de COS et de fragments de PG seront synthétisées par les chimistes et utilisées par les biologistes pour lier de manière covalente les protéines LOST dans des préparations de lysosomes intacts partiellement purifiés. Les protéines marquées seront purifiées et les protéines récoltées seront identifiées par protéomique quantitative. Les candidats LOST seront évalués et les protéines LOST confirmées seront régulées à la baisse dans des cellules afin de déterminer leur rôle dans la production de fOSp. De nouveaux substrats LOST fluorogènes, dont la fluorescence est amplifiée une fois à l'intérieur du lysosome, seront synthétisés et utilisés pour développer des tests LOST simples en temps réel et pour visualiser l'action de LOST par microscopie en fluorescence.
Résultats attendus. Nouveaux outils chimiques pour étudier le transport lysosomal des oligosaccharides. Identification de la (les) protéine(s) LOST et développement de tests de fluorescence en temps réel et d’approches de microscopie en fluorescence pour l'étude de LOST. Manipulation génétique de l’expression des gènes LOST pour comprendre le rôle de LOST dans les processus normaux et pathophysiologiques.
Impact et bénéfices. LOST pourrait être impliqué dans le métabolisme du fOS mais aussi réguler d'autres oligosaccharides (COS et fragments de PG bactériens). Nos recherches sur LOST intéresseront les spécialistes des sciences des glucides et les scientifiques dans les domaines des interactions pathogènes/hôtes, de l'immunité innée et de l'inflammation. Enfin, plusieurs maladies héréditaires rares sont associées à une altération du métabolisme des fOS et l'identification de LOST au niveau moléculaire sera cruciale pour les cliniciens et les scientifiques en charge de patients potentiellement déficients en LOST.