Mécanismes moléculaires des pontages oxydatifs entre ARN et protéine – OxiXlink

Les protéines jouent de multiples rôles dans le métabolisme de l’ARN, régulant presque tous les aspects des fonctions de l’ARN et forment des complexes stables non covalents, principalement médiés par des charges électrostatiques et des liaisons hydrogène. Dans ces complexes, des groupes chimiques d’ARN et de protéines hautement réactifs médiés par le stress oxydatif peuvent également former des liaisons covalentes, formant des adduits de pontage très stables (X-links). De tels adduits covalents ARN-protéine sont rapportés dans la structure du ribosome et apparaissent dans la condition du fort stress oxydatif intracellulaire. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents de la formation des X-links dans ces conditions restent encore largement inexplorés.
Pour répondre à ces questions, nous utiliserons des phages à ARN entérique F-spécifique combinant ssRNA(+) et des protéines de capside. Les données préliminaires obtenues sur les virions Qß et MS2 natifs montrent que l’oxydation abroge l’infectiosité du virus, en empêchant probablement l’injection d’ARNv dans la cellule hôte ou même en empêchant l’étape de traduction post-infection. Nous avons développé des modèles in vitro pour mieux comprendre l’emplacement et la nature des potentielles X-links ARN-protéines et pour déchiffrer les mécanismes moléculaires conduisant à la formation de liaisons ARN-protéine lors de l’exposition de complexes ARN-protéines modèles à des agents oxydatifs légers (et physiologiques), tels que l’acide hypochloreux (HOCl), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le peroxynitrite (ONOO-).
La caractérisation des liaisons ARN-protéine dans de tels systèmes peut être réalisée par la très puissante méthodologie LC-ESI-Q-TOF MS/MS. Pour la formation de liaisons X -links covalentes lors de l’exposition à HOCl, cette stratégie analytique a déjà été validée pour le modèle combinant des dimères CP et une séquence d’ARN (environ 20 nucléotides) de l’opérateur du gène de la réplicase de phage. Les relations structure-fonction aux niveaux CP/MP et ARN seront étudiées pour définir la base moléculaire responsable de la formation de telles liaisons. En combinant les informations structurelles sur les modes de liaison ARN-CP ou ARN-MP, les données AbOxiSeq et les « expériences de X-links in vitro » réalisées sur des séquences CP/MP et ARN mutées, nous allons définir le modèle minimal d’interactions ARN-CP/MP et/ou d’éléments structurels qui permettent la formation de X-links dans le phage MS2. Pour obtenir des informations moléculaires sur l’emplacement de tels sites réactifs à la résolution nucléotidique, nous utiliserons une variante du protocole AlkAnilineSeq précédemment publié. Ce protocole variant (appelé ici AbOxiSeq), détecte préférentiellement les sites abasiques de l’ARN, en raison des conditions modifiées de clivage de l’ARN. L’application d’AbOxiSeq permettra une cartographie précise des résidus nucléotidiques sensibles à l’oxydoréduction dans les ARN modèles. Étant donné que cette technologie n’est pas limitée par la taille de l’ARN, la cartographie peut être effectuée efficacement à l’aide d’ARN modèles (de 40 nucléotides ou plus), ainsi que d’ARN phages / viraux complets extraits de VLP intacts ou de phages / particules virales. La sensibilité de la méthode est très élevée et la formation de sites abasiques a été détectée pour les particules de phage MS2 et l’ARN nu exposés à HOCl.
Dans notre projet, nous utiliserons une combinaison de la de caractérisation par la spectrométrie de masse très sensible avec une analyse à haut débit des sites AP ARN par séquençage à haut débit. Les adduits ARN-protéine induits par l’oxydation sont probablement une caractéristique commune des conditions de stress oxydatif in vivo, mais on sait peu de choses sur leur formation, leur stabilité et leur fonction potentielle (ou perte de fonction) dans la cellule.