Analyse de la dynamique de synthèse et de maturation de la paroi cellulaire bactérienne à l'échelle nanométrique – NanoWall

La paroi cellulaire joue un rôle majeur dans la prolifération, la survie et la virulence bactérienne. Les processus moléculaires responsables de son architecture et de sa composition finale sont toutefois encore largement incompris. Le peptidoglycane (PG) et les acides teichoïques (AT) sont les deux composants majeurs de la paroi des bactéries Gram-positives. La paroi est assemblée dans des régions cellulaires de dimensions nanométriques, nécessitant la mise en œuvre de méthodes d’étude à haute résolution. Dans ce but, le projet NANOWALL réunit trois partenaires aux expertises complémentaires en chimie de synthèse, imagerie cellulaire super-résolue, biochimie, spectroscopie RMN (résonnance magnétique nucléaire) et génétique microbienne. Grâce à cette synergie d’expertises, le projet vise à élucider la dynamique de synthèse et de maturation des AT et du PG, et à mettre en évidence les mécanismes moléculaires qui coordonnent leur métabolisme. Il se concentre sur le pathogène humain Streptococcus pneumoniae, dont les processus d’assemblage de la paroi sont proches de ceux de nombreuses espèces pathogènes (streptocoques et entérocoques). Le projet NANOWALL permettra de mieux comprendre comment la surface cellulaire des bactéries Gram-positive est façonnée au cours de différentes phases de croissance, ce qui constitue un aspect essentiel de leur physiologie. Le métabolisme du PG et des AT étant associé à la virulence de S. pneumoniae et à sa sensibilité aux antibiotiques, le projet génèrera par ailleurs des informations importantes pour la compréhension des interactions hôte-pathogène et la découverte de nouvelles stratégies antibactériennes.
Les atouts de NANOWALL reposent sur des stratégies originales développées dans les laboratoires des participants pour le marquage métabolique de la paroi par chimie click, couplé à des analyses in vivo et in vitro. En 2021, une première étude en microscopie à fluorescence super-résolue dSTORM (direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy, environ 25 nm de résolution) nous a permis de corréler les processus d’élongation et de division cellulaire avec la dynamique (localisation, séquence temporelle, quantification) de deux modes d’assemblage du PG. L’étude a montré le découplage progressif de ces deux modes d’assemblage dans le temps et l’espace, et a révélé les paramètres cinétiques des évènements de synthèse et de maturation qui y sont associés. Elle a ainsi permis de mieux comprendre comment S. pneumoniae acquiert sa forme ovoïde. En étendant cette étude aux AT, dont le métabolisme est lié à celui du PG, le projet NANOWALL dévoilera la contribution de ces polysaccharides complexes à la constitution et au maintien de la forme et de l’intégrité de la paroi cellulaire. La mise en place d’expériences de co-marquage et de dSTORM en deux couleurs permettra par ailleurs de visualiser le PG et les AT néo-synthétisés au sein d’une même cellule afin de mieux caractériser la coordination de leurs processus d’assemblage.
De façon intrigante, les protéines qui se lient aux AT présentent des localisations différentes les unes des autres, suggérant que la composition des AT varie à la surface de la cellule. Un autre objectif du projet NANOWALL sera donc de corréler la taille et la composition des AT avec leur distribution spatiale. Pour cela, les AT seront analysés par biochimie, RMN et spectrométrie de masse.
Les analyses cellulaires et moléculaires seront réalisées sur des souches sauvages et mutantes de S. pneumoniae (dont le phénotype sera également caractérisé par des approches plus classiques en microscopie électronique cellulaire et microscopie optique) pour disséquer la contribution de gènes clés liés à l’assemblage des AT et du PG, et identifier des interactions moléculaires entre ces processus. Enfin, la comparaison de données obtenues au cours des phases de croissance exponentielle, stationnaire et lytique permettra de caractériser les variations associées à la physiologie bactérienne.