Contrôle de la recombinaison homologue - Dynamique des protéines associées au filament nucléoprotéique Rad51 – SafeHR

La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin (CDB) de l'ADN, conservé chez tous les organismes. Chez les eucaryotes, la RH dépend de la formation de filaments nucléoprotéiques de la recombinase Rad51 sur un ADN simple brin. Ces filaments permettent de scanner le génome à la recherche d’un ADN homologue qui est utilisé comme matrice pour la synthèse réparatrice. L'objectif du projet SafeHR est de définir les mécanismes à l’origine de la régulation de la formation, de la stabilité et de la dissociation des filaments Rad51 qui empêchent des événements de recombinaison toxiques non programmés de se produire. Ces mécanismes sont liés à l'action de régulateurs négatifs et positifs qui influent sur la dynamique des filaments Rad51. Récemment, le Partenaire 1 a montré que le facteur majeur de formation des filaments Rad51, Rad52, reste associé aux filaments et inhibe leur démantèlement par l’ADN hélicase Srs2. Les complexes constitués des protéines paralogues de Rad51, Rad55-Rad57 et SHU, sont également impliqués dans cette inhibition. Grâce à une approche multidisciplinaire de génétique, de biologie moléculaire, de biochimie, de structure des protéines et de microscopie et en utilisant la levure comme organisme modèle, notre consortium prévoit de définir la structure et la dynamique de l’association de ces protéines avec les filaments Rad51, afin de déterminer les mécanismes de régulation et la cause de leur toxicité potentielle.
Notre consortium comprend quatre équipes qui travaillent dans les domaines de la réparation de l'ADN et de la RH en utilisant des approches complémentaires. Grâce aux approches structurales (modélisation, RMN, cristallographie et cryo-EM) et à la génétique, les partenaires 1 et 2 ont initié la caractérisation de l'assemblage de Rad52, Rad55-Rad57 et SHU au sein des filaments Rad51. Ces études seront poursuivies en collaboration avec le partenaire 4 par des approches de biologie structurales intégratives. Cette stratégie nous permet dès à présent de concevoir des mutations qui affectent des interactions spécifiques et d'évaluer précisément le rôle de chacune de ces interactions. Ceci constituera une avancée considérable par rapport aux études précédentes qui ont utilisé des approches de délétion complète de gènes. Associées à la construction d’une protéine de fusion Rad51-GFP par les Partenaires 2 et 3, qui pour la première fois permet l’étude par microscopie de filaments Rad51 fonctionnels in vivo, ces mutations nous permettront de déterminer le rôle de Rad52 et des différents paralogues de Rad51 dans la RH induite par les CDBs ou par des cassures simple brin d’ADN (CSB). Cette stratégie permettra également de comprendre les mécanismes d'inhibition de l'hélicase Srs2 par les effecteurs positifs des filaments Rad51. Enfin, le Partenaire 1 a développé un système cellulaire permettant d'induire de manière synchrone la formation de filaments Rad51 toxiques, qui sera utilisé pour étudier en profondeur les causes et les conséquences de leur formation.

Le projet est organisé en quatre axes de travail (WP):
WP1 vise à déterminer la structure de l'interaction Rad52-Rad51 et son rôle dans la formation et la stabilisation du filament Rad51. Les outils de microscopie nouvellement développés par le Partenaire 3 et les mutants de séparation de fonction identifiés par les Partenaires 1 et 2 seront utilisés pour évaluer quantitativement l'impact de Rad52 sur la nucléation et la stabilité des filaments Rad51.
WP2 consiste à poursuivre la détermination de la structure des complexes Rad55-Rad57 et SHU en association avec le filament Rad51 et à comprendre l'implication de ces complexes dans la réparation des DSBs ou des CSBs.
WP3 consiste en la détermination des mécanismes d'inhibition de Srs2 par Rad52 et les paralogues de Rad51.
WP4 établira la base moléculaire des filaments toxiques Rad51 en utilisant le système génétique construit par le partenaire 1.