Le croisement intersystème inverse : une nouvelle méthode pour réduire le photoblanchiment et la phototoxicité en imagerie de fluorescence – IMARISC

En imagerie de fluorescence in vivo, la phototoxicité et le photoblanchiment des protéines fluorescentes (PF) obligent à limiter fortement la dose de lumière d’excitation, au détriment du contraste des images, de la résolution spatio-temporelle et de la durée des expériences. Il est généralement admis que ces deux processus impliquent comme intermédiaires les états excités triplets des PF et de certains photosensibilisateurs endogènes (PS) des familles des porphyrines et des flavines. Les états triplets peuvent en effet interagir avec l’oxygène pour former de l’oxygène singulet et d’autres espèces réactives qui oxydent les fluorophores et les composants cellulaires et provoquent des réponses au stress indésirables.
Notre consortium de photochimistes et de microbiologistes propose de développer et valider une nouvelle méthode pour réduire le photoblanchiment des PF et la phototoxicité en imagerie de fluorescence sur des cellules vivantes. Cette méthode exploitera un processus photophysique appelé croisement intersystème inverse (CIS-i) pour dépeupler les états triplets avec de la lumière. Le CIS-i est un mécanisme répandu qui a en particulier été mis en évidence dans certaines porphyrines et flavines ainsi que dans des PF bleues, vertes, jaunes et rouges. Cependant, le CIS-i est resté sous-exploité en imagerie de fluorescence. Dans ce projet, nous l’induirons en co-illuminant les échantillons, pendant leur excitation, à une ou plusieurs longueurs d’onde absorbées par les états triplets des PF et des PS.
La conception des schémas d’illumination reposera sur une combinaison d’approches de spectroscopie résolue en temps, de microscopie sous illumination duale et de modélisation photophysique. Nous commencerons par mesurer les spectres d’absorption, les rendements et les durées de vie de triplet des PS et de PF de toutes les couleurs depuis le bleu jusqu’à l’infrarouge par spectroscopie d’absorption transitoire micro-milliseconde. Les rendements de CIS-i seront également déterminés grâce à des expériences originales de spectroscopie femtoseconde à 3 impulsions. Nous exploiterons les spectres de triplet pour étudier in vitro puis in vivo l’effet du CIS-i induit à une longueur d’onde appropriée sur le photoblanchiment des PF et la phototoxicité des PS, dans une large gamme d’intensités lumineuses. La phototoxicité sera quantifiée par la production d’oxygène singulet, détecté par sa luminescence proche infrarouge, ainsi que par des indicateurs physiologiques tels que la vitesse de croissance de colonies bactériennes. Nous construirons ensuite des modèles photophysiques intégrant l’ensemble des données spectroscopiques et rendant compte de l’effet du CIS-i sur le photoblanchiment des PF et la phototoxicité des PS ainsi que de sa dépendance par rapport aux intensités lumineuses. Ces modèles nous serviront à optimiser la co-illumination pour des échantillons contenant une ou plusieurs PS et/ou couleurs de PF. La nouvelle méthode d’imagerie à faible phototoxicité et faible photoblanchiment sera enfin validée dans le contexte de l’étude de la fidélité de réplication de l’ADN chez E. coli par vidéo-microscopie de fluorescence plein champ à une et plusieurs couleurs.
Notre projet devrait avoir un impact majeur dans le domaine de l’imagerie de fluorescence. La nouvelle méthode est en effet simple techniquement, potentiellement compatible avec un grand nombre de PF et d’échantillons biologiques, et efficace d’après nos résultats préliminaires. En autorisant l’utilisation de doses de lumière d’excitation plus élevées, elle devrait conduire à des gains importants en contraste, en résolution spatio-temporelle et en durée d’expérience et donner ainsi accès à une variété de nouvelles informations biologiques. En réduisant la phototoxicité endogène, particulièrement importante dans le bleu, elle pourrait en outre conduire à une réhabilitation des PF bleues et cyans, ce qui représenterait une avancée très importante pour l’imagerie multi-couleur.