Compréhension globale de la reconnaissance de la séquence de Kozak sur le ribosome humain – Kozak

J'ai commencé le projet en optimisant la production de complexes endogènes sur différents ARNm en termes de reproductibilité, de quantités et de qualité des grilles cryo-EM pour les études structurales. Les premières données à haute résolution ont été recueillies sur l'appareil de pointe G4 Titan Krios qui a été récemment installé au CBI/IGBMC.
En outre, nous avons commencé à purifier l'ARNt initiateur humain à partir de cellules HeLa et à analyser la pureté ainsi que les modifications chimiques de l'ARNt par spectrométrie de masse. L'ARNt sera utilisé pour des études structurales de complexes reconstitués in vitro.
Enfin, nous avons commencé le développement des essais fonctionnels in vivo.
Ensuite, je passerai à l'étape suivante: (i) l'utilisation et le développement des dernières technologies de cryo-EM et de traitement d'images pour obtenir une structure à haute résolution d'un complexe humain d’initiation de 48S afin de mieux observer et analyser le rôle de tous les facteurs possibles impliqués dans les interactions entre l'ARNm, la petite sous-unité ribosomique 40S et l'ARNt initiateur ; (ii) en introduisant des mutations ponctuelles dans la séquence de Kozak de l'ARNm ou dans les facteurs d'initiation impliqués dans sa reconnaissance, et en analysant l'effet de ces mutations par des tests structuraux et fonctionnels.

- Nous avons obtenu les premières données pour la séquence de Kozak parfaite dans laquelle nous pouvons observer le signal de cler pour l'ARNm ainsi que le positionnement des chaînes latérales des facteurs d'initiation impliqués dans la reconnaissance de la séquence de Kozak. L'interprétation structurale de ces données est en cours.

- Nous avons récemment recruté une étudiante pour travailler sur la reconstitution in vitro des complexes d'initiation de la traduction. Elle a réussi à obtenir de l'ARNt initiateur humain et travaille à l'amélioration de la purification.

- Nous sommes en train de développer un pipeline pour interpréter les données fonctionnelles in vitro.

- Les études structurales seront désormais étendues aux mutants de l'ARNm et de l'eIF1A ainsi qu'aux approches visant à reconstituer le complexe in vitro.
- Les études fonctionnelles seront étendues pour analyser plus globalement l'impact des mutants de l'ARNm et de l'eIF1A.

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La synthèse de protéines chez les eucaryotes dépend de la bonne reconnaissance du codon d’initiation AUG lors de l’initiation de la traduction. La reconnaissance est particulièrement efficace lorsque l’ARNm comprend une séquence de Kozak forte, qui est définie par les nucléotides spécifiques qui entourent le codon d’initiation AUG. Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent, par exemple, comment les facteurs d’initiation ou les composants du ribosome participent à la reconnaissance de la séquence de Kozak, reste inconnu.
J’ai obtenu une résolution à environ 3Å des structures cryo-EM de complexes d’initiation avec et sans facteurs de traduction, révélant les interactions moléculaires entre la séquence de Kozak, eIF1A, eIF2 et le ribosome. Ces structures donnent un aperçu des détails moléculaires par lesquels le ribosome, eIF1A et eIF2, sont impliqués dans la reconnaissance de la séquence de Kozak et elles fournissent également des informations sur les interactions moléculaires de la séquence de Kozak avec le ribosome pouvant être utilisées pour concevoir des analyses fonctionnelles et structurales de la reconnaissance de la séquence de Kozak pendant l’initiation de la traduction. Dans ce projet, je souhaite caractériser davantage le mécanisme moléculaire de la reconnaissance de la séquence de Kozak en étendant l'analyse vers : (i) l'utilisation et le développement des dernières technologies de cryo-EM et de traitement d'images pour obtenir une structure à haute résolution d'un complexe humain d’initiation de 48S afin de mieux observer et analyser le rôle de tous les facteurs possibles impliqués dans les interactions entre l'ARNm, la petite sous-unité ribosomique 40S et l'ARNt initiateur ; (ii) en introduisant des mutations ponctuelles dans la séquence de Kozak de l'ARNm ou dans les facteurs d'initiation impliqués dans sa reconnaissance, et en analysant l'effet de ces mutations par des tests structuraux et fonctionnels. Cette étude permettra de comprendre le rôle des eIFs dans la distinction entre le consensus de Kozak et les variants de séquence, et révélera comment les codons de départ sont sélectionnés lors de l'initiation de la traduction chez l'homme, ce qui a des applications directes pour les stratégies de clonage et les thérapies basées sur l'ARNm.