Structure de la machine de réplication de l'ADN des poxvirus par cryo-microscopie électronique – PoxRep

Nous proposons d'élucider la structure et la fonction de la machinerie de réplication de l'ADN des poxvirus par cryo-microscopie électronique (cryo-EM). La famille des poxvirus comprend des membres ayant un fort risque zoonotique, tels que la variole du singe, qui entraîne des épidémies locales en Afrique avec un taux de mortalité d'environ 2 %. En outre, les poxvirus sont un risque important dans le cadre du bioterrorisme. Ces virus se répliquent dans des usines virales cytoplasmiques sans nécessiter la synthèse de protéines de la cellule hôte. La structure du génome n’est partagée qu’avec les asfarvirus et est constitué d’un ADN double brin avec des extrémités circularisées. Il n'existe pas de modèle consensuel pour la réplication l’ADN de ces virus. Elle implique l’holoenzyme de l'ADN polymérase, composé de la polymérase E9, d'une protéine structurelle A20 et d'une uracile-ADN glycosylase D4 formant le facteur de processivité. De plus, elle nécessite l'hélicase-primase D5, la protéine I3 de liaison à l'ADN simple brin et l'ADN ligase A50. Nous proposons de déterminer les structures de l'holoenzyme E9-A20-D4 en complexe avec plusieurs substrats d'ADN mimant différentes étapes de l'action de la polymérase. L’interaction de D5 avec l’ADN sera analysée de la même façon afin de reconstituer les composantes de la fourche de réplication. Dans un deuxième temps, l'analyse pourrait inclure l'interaction directe entre E9-A20-D4 et D5 ou d'autres protéines impliquées dans la réplication de l'ADN. La structure dynamique des complexes avec l'ADN a empêché jusqu'à présent la détermination de la structure par cristallographie, mais avec les techniques de classification de la cryo-EM ces structures sont maintenant à portée de main. Nous pouvons profiter de notre travail cristallographique et biophysique sur plusieurs acteurs protéiques, de nos systèmes d'expression existants et de nos résultats préliminaires sur la cryo-EM des complexes en absence d’ADN.