Bactéries associées aux lichens comme source d'agents antimicrobiens – AMALIA

Le projet AMALIA était organisé en 6 « Work Packages . Le WP0 correspondant à la gestion du projet.

Dans le WP1 « Criblage rapide », nous avons criblé la collection par lots de 50 souches en utilisant un seul milieu, une seule condition de croissance et deux solvants d’extraction. Les extraits ont été testés contre des souches multirésistantes à 100 µg/mL dans des essais en culture liquide afin d’identifier rapidement les souches promettantes de la collection, qui ont ensuite été développés dans les WP3 à WP6.

Le WP2 correspondait au « Développement de méthodes ». Nous avons utilisé S. cyanofuscatus BBCC1488 et d’autres souches de Streptomyces pour développer et optimiser une méthode de criblage rapide par imagerie de spectrométrie de masse (Mass Spectrometry Imaging, MSI) sur des colonies en interaction avec d’autres organismes, ainsi que pour la détection de métabolites et de petites molécules. Nous avons également développé une méthode visant à bloquer la biosynthèse du principal métabolite bioactif, la N-méthyl-dactinomycine, chez MOLA1488 et d’autres souches de Streptomyces au moyen de l’édition génomique CRISPR-BEST (en remplacement de CRISPR-Cas9).

Dans le WP3 « Criblage secondaire », nous avons mené une analyse plus approfondie des souches afin d’exclure celles (et les extraits correspondants) capables de produire des antibiotiques déjà connus, en : 1) analysant les extraits par métabolomique non ciblée, 2) séquençant leurs génomes et 3) recherchant une activité anti-persistance des extraits

Le WP4 correspondait à la « Production et identification de métabolites ». Nous avons utilisé différentes techniques pour améliorer la production de molécules, notamment la modification des voies de biosynthèse par ingénierie ribosomique et édition génomique, ainsi que la culture en chémostat. Cette optimisation a été suivie d’une isolation à grande échelle des molécules et de la détermination structurale par spectroscopie RMN.

Le WP5, initialement prévu comme « Essais cellulaires » pour déterminer les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des fractions et des molécules purifiées contre plusieurs souches multirésistantes et persistantes, ainsi que la toxicité sur sept lignées cellulaires humaines afin d’évaluer le potentiel de développement pharmacologique, n’a pas été réalisé, car nous n’avons pas identifié de nouvelle molécule adaptée à un développement.

Enfin, nous avons mené, dans le WP6, des actions de valorisation des connaissances et de diffusion scientifique.

Nous avons généré des extraits chimiques bruts pour 417 souches bactériennes en utilisant deux solvants, soit un total de 1007 extraits. Ces extraits ont été testés tels quels (ou sous forme de fractions) contre 7 bactéries pathogènes (groupe ESKAPE plus Salmonella enterica), pour un total de 8697 tests unitaires et 3483 tests réalisés en triplicat. Les résultats ont permis d’identifier 45 souches d’intérêt pour un développement ultérieur. Plusieurs souches appartenant à une même espèce présentaient des activités différentes, confirmant que la dé-réplication risquerait de manquer des molécules potentiellement bioactives.

En parallèle, nous avons obtenu des séquences génomiques pour 31 souches. Nous avons finalisé l’analyse métabolomique non ciblée (annotation LC-MS2 et réseau moléculaire pour 168 fractions / 7 souches), ainsi que l’imagerie MSI pour 11 souches. Les résultats indiquaient que la plupart des fractions actives contenaient des classes de molécules déjà décrites, telles que les surugamides, la lichenysine et la collismycine, entre autres, en accord avec les clusters de gènes de biosynthèse identifiés dans les génomes. Dans certains cas toutefois, des fractions actives contenaient des molécules jusqu’alors non identifiées ; nous avons donc retenu 4 souches de ce type pour la suite du pipeline.

Ces souches — identifiées comme Micrococcus alloeverae (1917), Micromonospora chalcea (1924) et S. cyanofuscatus (1493 et 1615) — ont été cultivées en bioréacteurs en chémostat. Comme nous avons perdu la bioactivité pour 1493, nous avons opté pour une culture semi-continue. Les extraits de deux souches ont été soumis à l’isolement de composés et à la détermination structurale par RMN. La structure de 14 composés a été élucidée, tous déjà décrits dans la littérature, tandis qu’un peptide potentiellement nouveau est en cours d’isolement. La structure de certains de ces composés a pu être déterminée dès le mois 28, indiquant que l’objectif principal de rationalisation du pipeline a été atteint.

Le développement méthodologique a également produit des résultats intéressants. Nous avons appliqué l’édition génomique CRISPR-BEST à la souche 1488, suivie d’une culture dans différents milieux (approche OSMAC) et d’analyses LC-MS2, ce qui nous a permis de modifier le métabolome de la souche en supprimant la production de plusieurs analogues d’actinomycine. Plusieurs dérivés « nouveaux » déméthylés de l’actinomycine D et de l’actinomycine X2 ont été produits en milieu ISP2, mais ils ont fait l’objet de dépôts de brevets récents. Nous avons également mis en place un criblage d’activité anti-persistance sur E. coli pour 6 extraits bioactifs, sans toutefois observer d’effet. Enfin, nous avons déployé une méthode de profilage de colonies par MSI, adossée à une base de données interne, et nous avons détecté plusieurs composés prédits à partir des séquences génomiques, ouvrant la possibilité de cartographier des composés en culture sur milieu solide.

Nous avons l’intention de poursuivre notre collaboration et d’assurer un suivi via de futures soumissions de projets. Les extraits bruts issus d’AMALIA ont été déposés à la Chimiothèque Nationale ; ils seront disponibles pour des criblages à d’autres fins et ouvrent des perspectives de collaborations (académiques et industrielles, avec d’autres partenaires).

Nous disposons de dizaines de génomes à explorer et, grâce à la forte baisse des coûts de séquençage ainsi qu’à nos capacités internes d’assemblage et d’annotation, nous prévoyons de poursuivre le séquençage de souches de la collection AMALIA présentant un intérêt, tant pour le genome mining que pour le développement d’outils CRISPR-BEST afin de créer de nouvelles molécules par des approches d’ingénierie génétique, comme celles mises en œuvre pour la souche 1488 mentionnée ci-dessus.

Nous avons également plusieurs fractions actives contenant des composés potentiellement nouveaux, et nous comptons poursuivre leur purification ainsi que la détermination structurale. Enfin, plusieurs manuscrits sont en cours de préparation et nous prévoyons de les soumettre dans un délai relativement court.

La résistance et la persistance aux antibiotiques (RA) des microorganismes pathogènes sont des menaces pour la santé humaine, car le nombre d'antibiotiques efficaces contre ces bactéries est faible. Les interactions symbiotiques microbe-hôte dépendent souvent de molécules bioactives ayant un potentiel antibiotique. Grâce au projet ANR MALICA, nous avons acquis une collection de >500 souches bactériennes de lichens marins ayant un potentiel encore inexploité pour de nouveaux antibiotiques. Dans le cadre du projet AMALIA, la collection sera examinée dans son intégralité. Afin d’accélérer le criblage, nous développerons et appliquerons une nouvelle méthodologie utilisant l'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) et les réseaux moléculaires pour prioriser les souches et extraits contenant de nouvelles molécules. Le génome des microorganismes, codant pour diverses voies de biosynthèse silencieuses, nous développerons l'ingénierie ribosomique et l'édition génomique pour modifier le métabolome des souches et augmenter la diversité des antibiotiques produits. Afin de produire une masse suffisante de composés pour leur détermination structurale et les tests de bioactivité, nous combinerons les modifications des métabolomes et les cultures continues améliorant les rendements des molécules d'intérêt. AMALIA est un projet de 48 mois organisé en 6 défis (WP). Le WP0 est la gestion de projet qui garantira que les livrables soient atteints et assurera un accès ouvert aux données et aux ressources. Le WP1 sera focalisé sur un criblage préliminaire de toutes les souches ; le WP2, au développement des techniques de criblage par MSI et d'édition des gènes ; le WP3, à la réalisation d’un criblage et d’une caractérisation approfondis des souches prometteuses ; le WP4 inclut la production de biomasse à grande échelle et la détermination structurale des métabolites qui seront testés dans le WP5 ; Le WP6 comprend des activités de diffusion, y compris auprès du grand public. AMALIA sera coordonné par le Pr. Suzuki qui a une grande expérience dans la coordination de projets. Le consortium est issu d'une collaboration fructuseuse entre LBBM et ISCR. NUMECAN les a rejoint en collaborant avec ISCR pour trouver de nouveaux agents antibactériens. Nous avons aussi le Dr. N. Desbenoit du CBMN, CR CNRS, spécialisé dans la MSI et Olgram, une entreprise qui a développé des nouvelles stratégies de criblage de persistance des pathogènes et s' intéresse au développement des médicaments contre ces bactéries persistantes. LBBM est spécialisé dans la microbiologie et la génomique environnementales ainsi que la génétique des microorganismes (N. West). LBBM est aussi spécialisé dans la chimie analytique, les produits naturels, le profilage métabolomique et la recherche antibactérienne (D. Stien, A. Rodrigues). L'expertise de ISCR (Prof. S. Tomasi, resp.) porte sur la chimie des produits naturels (isolement, caractérisation, profilage, évaluation biologique). NUMECAN (Dr. L. Bousarghin, resp.) apporte son expertise sur les bactéries hypermutables et la RA. Nos approches visent à accélérer la filière de découverte, contribueront à d'autres activités de biodécouverte et un des impacts du projet sera le développement futur d'un antibiotique efficace. D'autres impacts se feront par la publication des résultats de la recherche et par la participation à des colloques internationaux. Nous diffuserons les résultats des projets au grand public par l'intermédiaire du Biodiversarium de Banyuls qui accueille le public dès l'âge préscolaire. AMALIA contribuera à la formation de jeunes scientifiques via des stages ou la formation d'ingénieurs juniors embauchés dans le projet. Nous faisons appel à des ingénieurs et des techniciens permanents ce qui contribuera à l'évolution de leur carrière. Plusieurs participants pourront utiliser les résultats et les données du projet pour transmettre des informations scientifiques récentes aux étudiants universitaires du premier cycle au doctorat.