Sondes multimodales à base de COV pour la biomédecine – Volatolomix

Dans le cadre de ce projet, la N-acétyl-β-glucosaminidase, la β-glucuronidase, l’α-L-fucosidase, la β-galactosidase,

l’α-mannosidase, la β-glucosidase et la sialidase ont constituées nos cibles. Des sondes hétérosidiques, constituées d’une partie glycone, substrat de chacune de ces enzymes, reliée à un alcool, l’éthanol (COV très volatil, passant facilement en phase gaz) ont été développées. Afin de différencier l’éthanol libéré après hydrolyse de l’une ou l’autre des sondes, ce dernier a été marqué au 13C, et/ou 2D, sur une (ou plusieurs) position(s). Une méthode de préconcentration des COVs par SPME couplée à une analyse ciblée par GC-MS/MS (mode MRM) a été développée pour préconcentrer et détecter tous les isotopes de l’éthanol. Cette méthode a permis une différenciation nette entre tous les isotopes suivant leur fragmentation en masse.

Une étude expérimentale exhaustive, dont l’objectif a été d’évaluer l’affinité, la sensibilité et les réactivités croisées des sondes a alors été réalisée. Les limites de détection des enzymes ont ensuite été déterminées en solution.

Nous avons ensuite développé une stratégie multiplexe, combinant protéomique et volatolomique afin de détecter les exoglycosidases directement dans des prélèvements biologiques, plasmas et tissus. L'objectif était double : (a) Mettre en œuvre une procédure simple, robuste et facilement reproductible, basée sur l’ajout dans des échantillons biologiques des sondes à base de COV afin d’y cartographier les activités enzymatiques ; (b) Suivant une approche protéomique, développer un protocole d’extraction et d’analyse des enzymes dans ces milieux. Cette stratégie multimodale, associant protéomique et volatolomique, devait permettre de cartographier les enzymes dites hyperactives qui pourraient alors servir de cibles biologiques pour le développement de nouveaux médicaments.

Une fois ces protocoles mis au point une étude clinique sur des échantillons de plasma a réalisée (collaboration avec les cliniciens du CIC INSERM 1402 du CHU de Poitiers et de la PHP Paris). Ces études de recherche clinique portant sur plusieurs dizaines patients avait pour objectif d'évaluer l'efficacité du cocktail de sondes à base de COV pour discriminer d’une part les patients sains des patients souffrant d'une infection ou d'une inflammation, et d’autre part de réaliser un suivi longitudinal de ces patients. Les réponses des sondes ont été corrélées aux données cliniques et biologiques des patients.

Après avoir défini les conditions optimales de détection des traceurs volatils et d’activation des sondes à COVs, nous avons développé un premier cocktail constitué de 4 sondes à COVs afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs glycosidiques associés au développement de tumeurs cancéreuses. A l’aide de ces sondes à base de COVs, nous avons alors mis en évidence une enzyme cible, la N-acétyl-glucosaminidase, présente in vivo et in vitro dans l’environnement des tumeurs du col de l’utérus et du sein triple négatif. Nous avons par la suite développé une prodrogue activable par cette enzyme et après des essais in vivo, nous avons pu guérir 4 souris sur 6 auxquelles des xénogreffes de tumeurs humaines mammaires avaient été implantées sans effets secondaires majeurs. Il n’existe actuellement pas de traitement spécifique de ce cancer et les chimiothérapies classiques n’empêchent pas la rechute. Ainsi grâce aux sondes à base de COVs, nous avons été en mesure de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques ce qui a permis le développement d’un nouvel agent chimiothérapeutique ayant une efficacité sans précédent.

En parallèle, nous avons optimisé un protocole d’analyse des activités glycosidiques sur biopsies solides afin de vérifier la pertinence du cocktail de sondes vis-à-vis de l’identification de lésions pré-néoplasiques. Cette étude a été réalisée sur le modèle de carcinogénèse gastrique liée à une infection par la bactérie Helicobacter pylori. Nous avons ainsi identifié deux enzymes dont l’activité pouvait être corrélée avec l'apparition des premiers signes de développement d'une tumeur cancéreuse. Ces résultats démontrent le potentiel des sondes à base de COVs pour détecter très précocement les premiers des tumeurs cancéreuses.

Enfin, nous avons développé un protocole afin d’étudier l’évolution de l’activité des glycosidases lors d’une infection. Nous avons ainsi étudié l’infection au virus du SARS-CoV-2. Nous avons identifié 3 glycosidases, l’α-mannosidase, la β-glucuronidase et la N-acétyl-glucosaminidases, sur-activées 8 jours après les premiers symptômes chez les patients atteints d’une forme grave du COVID-19 par rapport aux patients atteints de formes peu sévères. Ces 3 enzymes pourraient ainsi permettre de prédire l’évolution de la maladie. De plus l’une de ces enzymes a été identifiée comme marqueur d’infection. Il s’agit de la N-acétyl-glucosaminidase. Les deux autres enzymes, l’α-mannosidase et la β-glucuronidase étaient activées positivement 16 jours après les premiers symptômes. Nous avons observé via un essai d’infection in vitro que la β-glucuronidase n’était pas produite par les cellules infectées. En effet, nous n’avons pas détecté l’activité de cette enzyme sur les cellules infectées. Cette enzyme est donc probablement produite par d’autres cellules telles que les cellules immunitaires. Ce résultat démontre que nous sommes en mesure de prédire l'évolution d'une infection aigue vers une inflammation chronique.

Ce projet a naturellement débouché sur une étude clinique de grande envergure, et qui portera sur plus de 220 individus. Il s’agira ici de démontrer la pertinence de celle nouvelle approche pour ce qui est de la détection des cancers du sein, poumon et pancréas. Un second volet de l’étude consistera à démontrer la pertinence de cette approche pour ce qui du suivi de l’efficacité des protocoles thérapeutiques proposés aux patients diagnostiqués. Cette étude débutera mi-2026, et devrait durer 1,5 ans.

En outre, de nouvelles sondes à base de COVs sont en cours de développement pour détecter une septicémie chez des patients. En outre ces sondes devraient permettre de détecter rapidement les souches bactériennes en présence, ainsi que leur potentielle résistance aux antibiotiques.

Enfin, la stratégie ici proposée a fait l’objet d’une déclaration d’invention déposée en décembre 2020 avec un dépôt de brevet effectif en 2022 avec résultats à la clé. Ce dernier a été licencié par une start-up nationale, spécialisée dans le développement de nouveaux outils de diagnostic des maladies.

La volatolomique, discipline qui étudie les composés organiques volatils (COVs) produits par un système biologique, est un domaine scientifique émergent qui permet d’explorer les processus biologiques en temps réel. De nombreux COVs endogènes, présents dans l’haleine, la transpiration, l’urine ou les selles des individus seraient des marqueurs potentiels de diverses maladies, et pourraient être utilisés à des fins diagnostiques ou pour la stratification des patients dans le cadre de thérapies personnalisées. Cependant, l’utilisation clinique de ces marqueurs endogènes reste limitée en raison d’une grande variabilité inter-individuelle et d’une disparité inter-laboratoire pour ce qui est du prélèvement et de l’analyse des COVs dans les fluides ou gaz biologiques.
Dans ce contexte, nous émettons l'hypothèse qu'un mélange de COVs exogènes qui ne résulteraient pas des voies métaboliques endogènes mais plutôt de l’activation enzymatique d'une sonde exogène, permettrait d’améliorer la sensibilité et la spécificité de l’actuelle volatolomique. L’objectif de ce projet consiste donc à proposer une boîte à outils constituée d’une large gamme de sondes à base de COV marqués, permettant de détecter puis de suivre l’évolution des processus physiopathologiques en temps réel. Dans le cadre de ce projet, notre cocktail de sondes ciblera différentes glycosidases qui jouent un rôle clé dans de nombreux événements biologiques, tels que l'inflammation. Une fois métabolisées, les sondes libèreraient des COVs exogènes qui pourront alors être utilisés comme traceurs chimiques des activités métaboliques liées à l'inflammation. Avec ces sondes, nous envisageons de cartographier ces différents biomarqueurs enzymatiques à l'échelle moléculaire, cellulaire, tissulaire et de l’individu. Ces marqueurs pourraient alors être ciblés par de nouveaux agents thérapeutiques agissant de manière intégrative pour stopper la progression de la maladie.