Mécanisme de déposition de TBP sur les promoteurs des génes par le co-activateur SAGA – SAGA-TBP

L’initiation de la transcription est une étape essentielle à la régulation de l’expression des gènes. Pour initier la transcription, la protéine TBP doit être déposée de manière contrôlée aux promoteurs des gènes codant pour les protéines. L'interaction de TBP avec le promoteur déclenche l'assemblage d'un complexe de pré-initiation de la transcription (PIC). Comprendre la liaison, le renouvellement et la dissociation de TBP des promoteurs est donc une question d’importance fondamentale. Or, malgré des décennies de recherche, nous n’avons toujours pas de description quantitative et dynamique du mode de déposition de TBP, qui est séquestré sous forme inactive dans les complexes SAGA et TFIID. La première tâche de notre projet vise à combiner des analyses biochimiques et génétiques, des mesures de fluorescence et la cryo-microscopie électronique de molécules uniques (cryo-EM) pour identifier des intermédiaires fonctionnels clés permettant de décrire comment TBP se libère de SAGA, avec le concours du facteur TFIIA, pour se lier à l'ADN du promoteur.
TFIID et SAGA partagent un dispositif moléculaire similaire pour lier TBP, mais ont des rôles distincts dans l'expression des gènes. La transcriptomique et le profilage chromatinien par ChIP-seq indiquent que les gènes exprimés de manière constitutive dépendent de TFIID, tandis que les gènes hautement régulés nécessitent SAGA. Cette vision dichotomique a été remise en question par des études utilisant des allèles conditionnels et par l’analyse des ARNs nouvellement synthétisés montrant que SAGA agit sur l'expression de la plupart des gènes. À ce jour, les facteurs qui déterminent si un gène nécessite SAGA, TFIID, ou les deux, pour déposer TBP sur un promoteur restent inconnus. La tâche 2 vise à explorer la sélectivité de SAGA pour les promoteurs contenant une boîte TATA consensus, par opposition à TFIID, qui peut aussi déposer TBP sur des promoteurs sans séquence TATA. Nous analyserons comment TBP incorporé dans SAGA est déposé sur une grande variété de promoteurs par des méthodes EMSA, FRET et FCCS in vitro et par des approches in vivo de ChIP résolue dans le temps qui mettent de corréler les séquences des promoteurs avec le renouvellement de TBP. Nous générerons des hybrides TFIID/SAGA pour vérifier si les sous-unités de TFIID ou de SAGA interagissant avec TBP spécifient la reconnaissance de la séquence TATA. La tâche 3 explorera le rôle de Mot1 sur la libération de TBP incorporé dans SAGA. Mot1 interagit génétiquement avec Spt3 et pourrait réguler sa sélectivité aux promoteurs. Nous allons analyser si Mot1 agit sur la libération de TBP et si un complexe stable peut être formé entre Mot1 et SAGA afin d'analyser sa structure par cryo-EM.
SAGA est recruté aux promoteurs de gènes par des activateurs et la sous-unité Tra1 est considérée comme une cible majeure in vitro et in vivo pour leur liaison. A ce jour, ni les interfaces de liaison des activateurs ni les mécanismes de régulation allostérique reliant l’action des activateurs aux autres fonctions de SAGA n'ont été décrits. Par ailleurs, SAGA agit dans un environnement chromatinien qui doit être modifié et remodelé afin d'atténuer l'action répressive des nucléosomes sur l'initiation de la transcription. L'interaction fonctionnelle entre SAGA et l'organisation chromatinienne du promoteur n'a pas été abordée au niveau structural. La tâche 4 analysera la structure de SAGA lié à l'activateur Gcn4, et les effets de la liaison de l'activateur et de la chromatine sur la liaison de TBP au promoteur. Nous explorerons également l'effet à longue distance de SAGA qui relie les séquences activatrices placées 200 paires de bases en amont du site d’initiation.
Nos résultats apporteront un éclairage nouveau sur le mécanisme de liaison de TBP au promoteur, le mode de recrutement de SAGA par les activateurs, le rôle de la structure de la chromatine, ainsi que sur la façon dont TFIID et SAGA se partagent la charge de la transcription des gènes.