Reconstitution in vitro du mécanisme de transport de lipides catalysé par les flippases – FLIPPER

La répartition asymétrique des lipides sur les deux feuillets qui composent les membranes cellulaires est une caractéristique fondamentale des cellules eucaryotes. Alors que la phosphatidylcholine et la sphingomyéline sont préférentiellement localisées sur le feuillet exoplasmique des membranes des voies sécrétoires/endocytaires tardives dans la plupart des types cellulaires, la phosphatidylsérine (PS), la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate sont quasiment exclusivement trouvés sur le feuillet cytosolique. L’exposition de la PS sur le feuillet exoplasmique est un signal de reconnaissance des cellules en apoptose par les macrophages ou encore pour le déclenchement de la cascade de coagulation du sang. À l’intérieur de la cellule, la PS a un rôle essentiel dans la mesure où la charge conférée par ce phospholipide chargé négativement permet le recrutement de protéines à motifs polybasiques comme la petite GTPase K-Ras et la protéine EHD1, impliquée dans la fission membranaire, établissant un lien entre régulation de l’homéostasie de la PS et trafic vésiculaire.
L’asymétrie des lipides est maintenue grâce à des protéines transmembranaires appelées flippases (ATPases-P4) qui transportent des lipides du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes cellulaires, aux dépens de l’hydrolyse de l’ATP. La plupart des ATPases-P4 forment un complexe avec les protéines de la famille Cdc50, et cette association est essentielle à l’adressage correct des ATPases-P4 ainsi qu’à leur activité de transport de lipides. Il a été démontré que la flippase de levure Drs2-Cdc50 transporte spécifiquement la PS et que ce transport contrôle le trafic entre endosomes et membranes du trans-Golgi (TGN). Par ailleurs, des mutations d’ATPases-P4 ont été associées à des troubles neurologiques ainsi qu’à des pathologies métaboliques et hépatiques, soulignant le rôle crucial de l’asymétrie des lipides pour un fonctionnement cellulaire normal.
Nous avons précédemment démontré, par protéolyse ménagée, troncatures génétiques et données structurales à haute résolution, que l’activité du complexe Drs2-Cdc50 est autoinhibée par ses extrémités N- et C-terminales et activée par le phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P). Cependant, le mécanisme moléculaire qui sous-tend l’activation du transport de lipides par Drs2-Cdc50 reste énigmatique.
Récemment, la petite GTPase Arl1 et la protéine Gea2, un facteur d’échange GDP/GTP pour la protéine Arf (Arf-GEF), ont été identifiées comme interagissant respectivement avec les extrémités N- et C-terminales de Drs2. De plus, Arl1 et Gea2 stimulent le transport de lipides par Drs2-Cdc50 sur des membranes de TGN isolées. Arl1 s’associe également à Gea2, suggérant un mécanisme complexe de régulation de l’activité de transport de lipides catalysé par Drs2. Sur la base de travaux antérieurs et de nos résultats préliminaires, notre hypothèse de travail est que la liaison d'Arl1 et de Gea2 aux extrémités N- et C-terminales de Drs2 lève l'autoinhibition et active ainsi le transport des lipides par Drs2-Cdc50. Ainsi, en associant des approches biochimiques, in silico, et structurales à moyenne/haute résolution, FLIPPER a pour ambition de disséquer ce mécanisme de régulation, en reconstituant in vitro le rôle activateur de Arl1 et Gea2 sur le transport des lipides.
De façon à atteindre cet objectif, nous associerons notre expertise dans l'analyse structurale et biochimique des petites GTPases et des Arf-GEFs (J. Cherfils) avec des techniques de spectrométrie de masse structurale (C. Bechara), la détermination de la structure du complexe Drs2-Cdc50-Arl1-Gea2 par cryo-EM (J. Lyons/P. Nissen) et notre savoir-faire dans l’étude biochimique et de la fonction des flippases (G. Lenoir).
Notre proposition vise à fournir une base mécanistique pour l'activation de Drs2-Cdc50 in vivo et à révéler de nouvelles fonctions pour les petits GTPases et les grands Arf-GEFs tels que Arl1 et Gea2.