Proteomique spatiallement résolue pour l'étude des changements conformationnels dans la cas de la moele éipinère de rat lésée – STRUCTURAL

Ces dernières années, l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI (MALDI-MSI) est devenue un outil de premier choix pour détecter et localiser des centaines de biomolécules à partir d’une coupe de tissu sans marquage, sans homogénéisation et en une seule expérience. Cependant, malgré la richesse de l’information générée par cette approche, l’analyse des protéines est limitée aux plus abondantes et il est très difficile d’obtenir des informations sur leurs modifications post traductionnelles (PTMs). De plus, les interactions entre les protéines (PPIs), clés de la signalisation cellulaire, ne peuvent être caractérisées. Des approches classiques d’analyse protéomique bottom-up guidées par MALDI-MSI ont donc été utilisées sur des tissus pour rajouter cette dimension spatiale à la puissance d’identification des approches protéomiques à grande échelle. Néanmoins, elles ne permettent pas l’analyse à grande échelle des PTMs ni des PPIs. Dans le projet STRUCTURAL, nous proposons donc de développer des approches de protéomique structurale qui permettront d’obtenir ces informations importantes, à partir de protéines présentes dans les tissus dans leur microenvironnement natif. Les PPIs seront analysées grâce à une méthode optimisée de pontage chimique covalent (XL-MS). Les PTMs seront quant à elles caractérisées grâce à un protocole dédié de protéomique Top-Down (TDP). Ces deux approches seront tout d’abord optimisées sur des cerveaux de rats et étendues ensuite à l’étude du traumatisme médullaire (SCI). Les SCI sont des traumatismes dramatiques causant des déficiences motrices et sensorielles sévères. Ce projet repose sur la complémentarité de deux partenaires : le laboratoire PRISM Inserm U1192 présentant une grande expertise en MALDI-MSI et en protéomique spatialement résolue appliqués aux études cliniques incluant la SCI et l’unité MSBio (Institut Pasteur) qui est experte en protéomique structurale notamment en XL-MS et TDP.
Ce projet est divisé en 4 parties. La première vise à adapter la méthode de XL-MS aux conditions spécifiques de l’analyse spatiale de tissus. Le plus grand défi sera d’amener la sensibilité de l’approche à un niveau compatible avec la quantité limitée de protéines contenue dans une coupe de tissu (moins d’1 mm² ; 1-5 µg de protéines) tout en augmentant la résolution spatiale. Le protocole eXL-MS, déjà développé par l’unité MSBio, servira de base à ces futures optimisations. Il est basé sur un agent pontant trifonctionnel qui permet une purification efficace des peptides pontés par chimie-click. Dans la deuxième partie, un protocole de TDP permettant l’identification des protéoformes à partir de sections similaires de tissus (de même, moins d’1 mm²) sera développé. L’optimisation portera sur la préparation de l’échantillon et sur l’analyse LC-MS/MS des protéines intactes. Les données obtenues à partir des analyses XL-MS et TDP (à l’aide de spectromètres de masses orbitrappes de très haute résolution) seront combinées pour construire les réseaux d’interactions des protéoformes présents dans les cerveaux de rats. Dans la troisième partie, les stratégies développées ci-dessus seront employées pour identifier les PPIs et détecter les protéoformes différemment exprimées au niveau des SCI. Les expériences seront réalisées directement à partir de coupes de tissus au niveau des lésions médullaires, des régions rostrales et caudales ainsi qu’à différents temps après la lésion (1h, 12h, 7 et 10 jours). Les résultats obtenus nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes de régénération qui ont lieu autour des lésions médullaires. La dernière partie est liée au management du projet.
Les méthodes développées dans ce projet permettront de repousser les limites dans le domaine de l’imagerie et d’apporter une toute nouvelle dimension à la protéomique spatialement résolue. Elles permettront de mieux comprendre les processus physiologiques et physiopathologiques pour des études cliniques liées à d’autres pathologies.