Imagerie des interactions métaboliques hôte-parasite dans le foie – iMET

- microscopie
- analyse FRET
- imagerie intravitale
- animaux transgéniques
- séquençage d'ARN «single-cell«
- micropatterning et culture cellulaire
- cytométrie en flux

WP 1. Imagerie l'hétérogénéité métabolique et de l'infection
Pour les études in vivo, une nouvelle colonie de souris transgéniques exprimant AMPKAR-EV a été établie avec succès dans un fond C57BL/6. Une expérience pilote d'infection a été réalisée en utilisant des sporozoïtes de Plasmodium berghei délivrés par injection intradermique. Nous avons comparé des animaux transgéniques à des souris de type sauvage issues de la même reproduction et de type sauvage C57BL/6 connu pour être sensible à l'infection à P. berghei. Toutes les souris ont montré des parasites dans le sang après 3 à 5 jours d'infection, ce qui indique un développement réussi au stade hépatique. Ces animaux transgéniques peuvent maintenant être utilisés pour l'analyse d'imagerie intravitale initialement prévue de l'infection. Une autre étude pilote a également été réalisée chez des souris non transgéniques pour optimiser les conditions d'imagerie en temps réel. Pour les expériences in vitro, le plasmide codant pour AMPKAR-EV a été obtenu à partir d'addgene, expansé, purifié et transfecté avec succès dans des hépatocytes humains primaires.

WP 2. Mécanismes d'interaction métabolique hôte-parasite
Des travaux menés pour un autre projet nous ont pointé vers le CD36, un transporteur de lipides régulé par l'AMPK. Nous avons constaté que les sporozoïtes de Plasmodium falciparum interagissent directement avec le CD36 à la surface de la cellule hôte et que la perte de CD36 dans la membrane des hépatocytes humains entraîne une réduction de l'infection. Nous poursuivons actuellement le lien avec l'AMPK. Notre hypothèse est que l'interaction du parasite avec CD36 dans la membrane de la cellule hôte déclenche une cascade de signalisation conduisant à la suppression de l'activité de l'AMPK, que nous avions précédemment démontré d'être favorable à l'infection à Plasmodium (Ruivo et al 2016).

WP3. Impact de l'hétérogénéité métabolique de l'hôte sur la dormance et l'efficacité des traitements
Nous avons analysé des données transcriptomiques précédemment collectées de parasites P. vivax dans des hépatocytes humains cultivés in vitro. Nous avons constaté que les hépatocytes hébergeant des hypnozoïtes dormants sont transcriptionnellement distincts de ceux contenant des parasites en réplication. Plus précisément, des transcrits de gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme du fer et des lipides, ainsi que plusieurs gènes codant pour des enzymes CYP450 métabolisant des composées, ont été détectés à des niveaux inférieurs dans les hépatocytes contenant des hypnozoïtes (Mancio-Silva et al 2022). Ces résultats appuient l'hypothèse selon laquelle l'état métabolique différentiel peut induire la dormance du parasite et conférer à l'hôte une résistance au traitement.

WP 1. Imagerie l'hétérogénéité métabolique et de l'infection
Les infections par les sporozoïtes de Plasmodium et l'analyse FRET in vivo et in vitro sont prévues pour le deuxième semestre 2022. Une fois les conditions d'infection seront optimisées avec des parasites de type sauvage, nous passerons à la réalisation d'infections avec des parasites transgéniques et utiliserons des médicaments modulateurs de l'AMPK (metformine et composé C) pour mieux comprendre les mécanismes.

WP 2. Mécanismes d'interaction métabolique hôte-parasite
Suite aux résultats obtenus pour CD36, knockdown par siRNA et la surexpression de ce facteur hôte seront réalisés dans des cellules transfectées avec AMPKAR-EV et l'infection sera évaluée par imagerie en temps réel. Pour la surexpression, nous utiliserons le plasmide mCherry-CD36-C-10 (55011) d'addgene. Un rôle potentiel de l'autophagie impliquant CD36 et AMPK sera également étudié.

WP3. Impact de l'hétérogénéité métabolique de l'hôte sur la dormance et l'efficacité des traitements
Pour valider les résultats obtenus par séquençage d'ARN «single-cell«, nous allons maintenant effectuer knockdown (par siRNA) de candidats sélectionnés avec et sans traitement médicamenteux et quantifier le nombre de formes d'hypnozoïtes dans les cultures infectées par P. vivax. Les composées qui seront testés comprennent la primaquine, la tafénoquine et les modulateurs AMPK (comme WP1 ci-dessus).

Single-cell views of the Plasmodium life cycle.
Real E, Mancio-Silva L. Trends in Parasitology. 2022 Jun 4:S1471-4922(22)00112-X. doi: 10.1016/j.pt.2022.05.009. PMID: 35672200

A single-cell liver atlas of Plasmodium vivax infection.
Mancio-Silva L, Gural N, Real E, Wadsworth MH 2nd, Butty VL, March S, Nerurkar N, Hughes TK, Roobsoong W, Fleming HE, Whittaker CA, Levine SS, Sattabongkot J, Shalek AK, Bhatia SN. Cell Host Microbe. 2022 Apr 13:S1931-3128(22)00164-0. doi: 10.1016/j.chom.2022.03.034. PMID: 35443155

Humanized mice for sustained Plasmodium vivax blood-stage infection and transmission.
Luiza-Batista C, Thiberge S, Serra-Hassoun M, Nardella F, Claes A, Nicolete VC, Commère PH, Mancio-Silva L, Ferreira MU, Scherf A,Garcia S. bioRxiv 2022.03.22.485265; doi: doi.org/10.1101/2022.03.22.485265

Les hépatocytes supportent la première amplification massive des parasites Plasmodium responsables du paludisme chez l'hôte mammifère. Malgré un parasitisme évident et une subversion des ressources des cellules hôtes, les mécanismes moléculaires impliqués dans la réplication à l'intérieur des hépatocytes restent largement inconnus. Il est acquis que des voies de signalisation métabolique sont légèrement différentes dans les cellules hépatiques infectées par Plasmodium par rapport aux cellules non infectées. Cependant, ces différences ont été mesurées en faisant une moyenne des populations cellulaires et sont probablement masquées par la forte hétérogénéité métabolique des hépatocytes entre eux. De plus, dans les études précédentes, il n'était pas possible de distinguer si les différences métaboliques étaient une réponse au parasite, ou si le parasite avait choisi de résider dans un hépatocyte où ces conditions étaient déjà en place. Avec ce projet, nous souhaitons comprendre si le parasite, pour envahir l’hépatocyte i) utilise des mécanismes de détection pour sélectionner la cellule dans laquelle la réplication pourra se dérouler et / ou ii) favorise une reprogrammation métabolique de l'hôte lors de l'invasion. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons les approches d'imagerie de cellules uniques en temps réel les plus avancées et des systèmes hépatiques in vitro de bio-ingénierie pour étudier la sous-population de cellules infectées par Plasmodium. Le stade hépatique de Plasmodium est la cible privilégiée pour une intervention thérapeutique antipaludique. La compréhension des bases moléculaires et de signalisation cellulaire des hépatocytes lors des interactions métaboliques hôte-parasite est donc fondamentale pour définir de nouvelles stratégies antipaludéennes.