Biogenèse, trafic et rôles des vésicules extracllulaires de Legionella pneumophila au cours de l'infection – BioEV

Nous analysons le(s) rôle(s) fonctionnel(s) de certains ARN contenus dans les vésicules extracellulaires bactériennes dans la cellule hôte à l'aide d'approches de biologie moléculaire et cellulaire. En parallèle, nous avons analysé le protéome et analyserons le contenu en métabolome, lipides et ADN des vésicules extracellulaires bactériennes pour définir leur contenu global, dans le but d'identifier des protéines (ou d'autres molécules) qui pourraient être impliquées dans le chargement d'ARN, le ciblage et relargage. De plus, la façon dont les vésicules extracellulaires bactériennes se forment, comment et où ils sont libérés et quelle structure ils ont, n'a pas été caractérisée. Ainsi, pour définir la structure exacte in vitro et in cellulo, nous utilisons Cryo EM et cryo-CLEM des vésicules extracellulaires bactériennes et humains. De plus, nous utilisons la microscopie 3D super-résolution dans les cellules humaines vivantes (hMDM) de la plateforme d'imagerie de l'Institut Pasteur pour répondre à ces questions. Nous utilisons également nos nouveaux tests où les vésicules extracellulaires bactériennes et humains contenant une cargaison étiquetée avec une split-luciférase (HiBiT) est chargée sur des cellules acceptrices exprimant la luciférase complémentaire dans leur cytosol (LgBiT). La complémentation de la luciférase se produit lors du mélange du contenu des vésicules extracellulaires bactériennes et humains et de la cellule acceptrice. Cela permet de visualiser le relargage de contenu et de caractériser le mode de transport des vésicules extracellulaires bactériennes et humains entre L. pneumophila et des cellules humaines. Les résultats ouvriront la voie à un nouveau domaine d'investigation, analysant le transport médié par les vésicules extracellulaires entre les bactéries et les cellules eucaryotes et l'impact sur les deux partenaires. Enfin, pour détecter une machinerie centrale putative dédiée aux vésicules extracellulaires conservée au cours de l'évolution, nous mettons en place une bibliothèque CRISPR-dCas9 knock-down de L. pneumophila, équipée d'un cargo marqué avec de la luciférase pour identifier les gènes qui inhibent la sécrétion de vésicules extracellulaires de L. pneumophila et leur livraison aux cellules humaines. Les résultats obtenus à partir du criblage génomique de L. pneumophila permettront de rechercher des homologues de mammifères.

- Nous avons montré pour la première fois que L. pneumophila utilise les vésicules extracellulaires pour transloquer les petits ARN bactériens (ARNs) dans les cellules hôtes qui agissent sur les voies de signalisation de défense de l'hôte
- Nous avons identifié des ARNs supplémentaires qui pourraient agir sur la réponse de l'hôte
- Nous avons identifié des protéines prometteuses, qui pourrait participer au chargement d'ARN dans les vésicules extracellulaires
- Nous avons identifié des protéines susceptibles de participer aux processus de fusion membranaire
- Nous pouvons mesurer l'absorption de vésicules bactériennes dans les cellules de mammifères

Les principaux objectifs futurs sont de continuer à analyser le(s) rôle(s) fonctionnel(s) des petits ARN sélectionnés que nous avons identifiés via RNAseq de L. pneumophila etant enrichis dans les vésicules extracellulaires et d'analyser des protéines spécifiques que nous avons identifiées via une analyse protéomique de vésicules extracellulaires de L. pneumophila. Nous mettons en place et affinons le test de livraison de contenu de vésicules extracellulaires pour étudier la libération du contenu de vésicules extracellulaires bactériens et de vésicules extracellulaires humains et l'impact des vésicules extracellulaires bactériens sur les vésicules extracellulaires humains. Nous avons obtenu la preuve de principe que CRISPRi fonctionne dans L. pneumophila et nous allons maintenant construire la bibliothèque guide pour le génome de L. pneumophila. Sur la base de nos résultats déjà obtenus et des outils mis en place pour obtenir de nouvelles connaissances originales sur la biogenèse, le trafic et leurs rôles fonctionnels des VE, notre projet impactera le domaine de la biogenèse et du trafic des vésicules extracellulaires en général et le domaine des interactions hôte-pathogène en particulier. Nous acquerrons des connaissances approfondies sur la façon dont les vésicules extracellulaires pathogènes sont capables de détourner les fonctions de l'hôte en délivrant des ARN et comment les vésicules extracellulaires des pathogènes et des eucaryotes se forment, sont structurés, circulent et peuvent s'influencer les uns les autres. Ainsi, nous révélerons au niveau cellulaire et moléculaire comment le transport médié par les vésicules extracellulaires impacte l'infection des cellules hôtes humaines par L. pneumophila, un mécanisme qui pourrait être généralisable à d'autres pathogènes intracellulaires à Gram négatif. Les résultats de notre projet auront un impact sur la biologie fondamentale des cellules et des infections en révélant de nouveaux mécanismes généraux de la biogenèse des vésicules extracellulaires et de nouvelles stratégies sur la façon dont les pathogènes contrecarrent les défenses de l'hôte. En outre, bon nombre des nouveaux outils et réactifs que nous allons générer seront disponibles pour l'ensemble de la communauté de recherche.

Sahr T, Escoll P, Rusniok C, Bui S, Pehau-Arnaudet G, Lavieu G, Buchrieser C (2022) Translocated Legionella pneumophila small RNAs mimic eukaryotic microRNAs to dampen the host immune response. Nature Communications, 13(1):762 doi: 10.1038/s41467-022-28454-x

Les vésicules extracellulaires (VE), produites par les eucaryotes, bactéries et archées sont de plus en plus reconnues comme d’importants médiateurs de la communication intercellulaire via le transfert d'une grande variété de molécules. Récemment, les VE de plusieurs agents pathogènes intracellulaires ont été impliquées dans la pathogénicité et la communication. Legionella pneumophila (Lp) est un de ces pathogènes bactériens, intracellulaire et responsable d’une pneumonie grave pouvant être fatale. Pour se répliquer dans la cellule hôte, Lp y sécrète plus de 300 protéines. Cependant, elle produit également des VE impliquées dans la virulence. Nous présumons que les VE bactériennes circulent dans les cellules hôtes eucaryotes et délivrent leur contenu à la manière des VE eucaryotes. Ainsi, nous proposons d’utiliser les VE de Lp comme modèle pour comparer et comprendre la biogenèse et le transit de vésicules bactériennes et eucaryotes, ainsi que le relargage de leur contenu dans l’hôte.