Génération des ponts interpeptidiques du peptidoglycane par des L,D-transpeptidases chez Clostridioides difficile: rôle dans la résistance aux antibiotiques et la libération des toxines – DIFFICROSS

Nous avons identifié trois LDTS chez C. difficile. Afin d'étudier leur fonction, nous allons créer une combinaison de mutants des gènes correspondants. Bien que la génération de mutants reste une tâche difficile chez C. difficile, nous avons récemment mis au point un nouveau système d'échange d'allèles qui permet la création de délétions en série chez C. difficile. La nature des liaisons interpeptidiques dans les différentes souches mutantes sera déterminée par l'analyse de la structure du PG des cellules végétatives de C. difficile ainsi que du cortex des spores en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). La morphologie cellulaire et l'intégrité de l'enveloppe cellulaire des mutants seront examinées par microscopie à contraste de phase et par microscopie électronique. La sensibilité des mutants aux ß-lactamines sera également étudiée par la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) pour diverses ß-lactamines. Nous développerons l'utilisation de D-amino-acides fluorogènes (FDAA) dans C. difficile pour suivre la synthèse du PG dans les cellules bactériennes par microscopie à haute résolution. En outre, nous construirons et visualiserons des fusions fluorescentes des LDT en utilisant des rapporteurs SNAP et HALO. Nous utiliserons le séquençage de sites d'insertion dirigé par transposons (TraDIS) sur une bibliothèque complète de transposons pour identifier tous les gènes nécessaires à la résistance aux ß-lactamines. Un vecteur de type mariner sera utilisé pour créer une bibliothèque de mutants aléatoire. Celle-ci sera ensuite cultivée en présence de concentrations subinhibitrices de ß-lactamines afin d'établir une liste exhaustive des gènes impliqués dans leur résistance. La relation entre les gènes impliqués dans la résistance aux ß-lactamines et la voie de L,D-transpeptidation sera ensuite étudiée. Des mutants des gènes sélectionnés seront construits et nous déterminerons l'impact des mutations sur l'abondance des liaisons interpeptidiques générées par les LDT par LC-MS/MS. Pour les protéines régulatrices, nous effectuerons une analyse transcriptomique comparative par RNA-seq pour identifier les changements d'expression génique dans chaque mutant. Nous suivrons la libération de toxines par ELISA dans les souches mutantes ldt. Un modèle d'infection chez le hamster sera également utilisé pour déterminer la contribution des LDT à la virulence de C. difficile. Nous étudierons la localisation des toxines dans les mutants ldt et tcdE. La localisation subcellulaire des toxines sera évaluée par immunoblotting des fractions cellulaires. La distribution spatiale des toxines sera également examinée en utilisant des fusions fluorescentes des toxines avec le rapporteur SNAP. Enfin, pour identifier l'endolysine transportée par l'holine TcdE, les protéines dans les fractions de la paroi cellulaire et du cytosol des mutants ldt et tcdE seront identifiées par LC-MS/MS et comparées.

La construction des mutants ldt est la première étape essentielle pour le succès de ce projet. Pour cela, nous avons utilisé une technique que nous avons récemment développé et qui s’avère très efficace pour la souche de laboratoire 630?erm. Nous avons d’abord tenté de générer des mutants dans la souche épidémique C. difficile UK1. Cependant, pour des raisons techniques, la génération de mutants dans cette souche s’est avérée beaucoup plus difficile que prévu et nous avons récemment décidé de poursuivre l’étude dans la souche 630?erm. Deux simples mutants ont déjà été obtenu et les combinaisons de mutants sont en cours. Ces difficultés ont retardé l’avancement du projet mais nous avons mis ce temps à parti pour optimiser les méthodes que nous utiliserons par la suite. Cela permettra une avancée plus rapide dans la seconde période. L’analyse de la composition du peptidoglycane de la souche UK1 par LC-MS/MS a permis de révéler une structure très similaire à celle de la souche de référence. Nous avons également mis au point une technique d’extraction du peptidoglycane des spores de C. difficile qui nous a permis d’établir sa structure fine. L’analyse de l’abondance des liaisons interpeptidiques réalisées par les LDT dans le peptidoglycane des spores est en cours. Nous avons également développé l’utilisation des acides aminés fluorescents pour le suivi de la synthèse du peptidoglycane et optimisé l’usage des codons des étiquettes fluorescentes de type Halo et SNAP pour obtenir une meilleure sensitivité chez C. difficile. Nous avons exprimé les 3 LDTs fusionnées à ces étiquettes et avons entrepris leur localisation cellulaire. La capture d’image a été réalisée à la plateforme d’imagerie photonique de notre institut de recherche, l’I2BC à l’aide d’un microscope à fluorescence de type spinning-disk. L’analyse des images obtenues est en cours Nous avons entrepris l’étude du mécanisme non lytique de liberation des toxines. Nous avons pu obtenir un mutant du gène codant la holine TcdE dans la souche UK1 de C difficile. Des analyses de détection de toxines par ELISA ont permis de montrer que TcdE joue un rôle essentiel dans la libération des toxines et la réalisation de fractionnement cellulaire ont révélé que les toxines s’accumulent entre la membrane et le peptidoglycane dans le mutant tcdE. Ces données sont en accord avec notre hypothèse que TcdE transporte une endolysine impliquée dans le transport des toxines à travers la couche épaisse de peptidoglycane. Pour identifier l’endolysine d’intérêt, nous avons conduit une analyse bioinformatique pour établir une liste de candidats. En parallèle, nous avons réalisé une analyse protéomique par LC-MS/MS sur les différentes fractions cellulaires de la souche sauvage et du mutant tcdE afin d’identifier l’endolysine. Cette expérience qui a permis de dégager des candidats va être répété dans différentes conditions de croissances afin de renforcer nos résultats.

A ce stade du projet, le retard que nous avons pris à realiser les mutants clés de l’étude ne nous permet pas de répondre aux principales questions posées mais nous espérons des progrès rapides dans les prochains mois grâce à notre optimisation anticipée des méthodes que nous utiliserons par la suite. Nos résultats ont révélé que la structure du peptidoglycane des cellules végétatives et des spores sont très semblable dans la souche historique de laboratoire 630?erm et la souche épidémique UK1. Cela suggère que les découvertes faites dans le cadre de ce projet seront applicables à de nombreuses souches de C. difficile et nous conforte sur le fait que l’utilisation de la souche de laboratoire comme modèle est justifiée. Concernant le mécanisme de libération des toxines, nous avons pu confirmer l’importance de la holine TcdE dans le processus. L’accumulation des toxines entre la membrane et le peptidoglycane dans un mutant tcdE plaide en la faveur de l’implication d’une endolysine pour digèrer localement le peptidoglycane et permettre la liberation des toxines. Nous avons pu identifier des endolysines candidates et la mutation prochaine des genes correspondants nous permettra d’étudier leur implication. D’une manière plus globale, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la résistance aux antimicrobiens et la virulence est une condition préalable au développement futur de stratégies préventives/thérapeutiques adaptées. De nouveaux médicaments ciblant spécifiquement la libération de toxines ou diminuant la résistance de C. difficile aux composés antimicrobiens doivent être développés car ils peuvent être administrés en prévention aux patients hospitalisés, là où les patients sont les plus vulnérables. De telles stratégies présenteraient un avantage économique et sociétal important, car elles amélioreraient le bien-être des patients et leur qualité de vie.

L'incidence de Clostridioides difficile a triplé au cours des 15 dernières années et cette bactérie est devenue le principal agent causal des diarrhées associées aux antibiotiques et aux soins hospitaliers. L'impact des infections à C. difficile (ICD) dans les hôpitaux est considérable en terme de mortalité, de morbidité mais aussi du cout généré par ces infections. Les souches virulentes de C. difficile produisent généralement deux toxines qui ont été identifiées comme les principaux facteurs de virulence. Cependant, le mécanisme de libération des toxines est encore mal compris. Les ICD sont difficile à prévenir et à traiter car ce pathogène est résistant à de nombreux agents antimicrobiens. Bien que la résistance de C. difficile aux ß-lactamines, la classe d'antibiotiques la plus couramment prescrite, soit l'un des principaux facteurs contribuant au développement des ICD, les mécanismes sous-jacents de la résistance sont actuellement inconnus. En raison de la nature insatisfaisante des thérapies actuelles pour les ICD, un impératif actuel est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance aux antibiotiques et dans le contrôle des étapes clés des ICD dans la perspective de développer de nouvelles thérapies préventives et curatives. . Chez C. difficile, la majorité des ponts interpeptidiques du peptidoglycane (PG) est synthétisée par des transpeptidases atypiques, les L,D-transpeptidases (LDTs), insensibles à l'inhibition par la plupart des antibiotiques de type ß-lactamines. Notre hypothèse est que les LDT sont des enzymes clés pour la biosynthèse du PG qui conférent la résistance au ß-lactamines et jouent un rôle crucial dans la libération de toxines chez C. difficile. Le but global de ce projet est donc de caractériser les trois LDT de C. difficile et leur role respectif. Notre premier objectif sera d'élucider les fonctions des LDT dans la biologie de la paroi cellulaire de C. difficile. Nous étudierons les rôles relatifs des voies inhabituelles de L,D-transpeptidation et des voies classiques de D,D-transpeptidation dans la formation des liaisons interpeptidiques pendant l'expansion et la maturation du PG de C. difficile. Nous déterminerons également dans quelle mesure les LDT sont importantes pour la morphologie cellulaire et la résistance aux ß-lactamines. Grâce à l'utilisation d'une approche génomique globale, notre second objectif sera d'identifier de nouveaux gènes régulant la voie de L,D-transpeptidation. Un sous-ensemble de ces gènes sera sélectionné pour une caractérisation plus approfondie. La libération de toxines de C. difficile repose sur des enzymes de degradation du PG, dont l'activité est contrôlée par des modifications structurelles du PG. Notre troisième objectif sera donc d'évaluer l'impact des LDTs sur la libération des toxines in vitro et sur la virulence in vivo. Nous identifierons également les acteurs moléculaires impliqués dans la libération des toxines chez C. difficile. Globalement, ces travaux fourniront des connaissances fondamentales sur la biosynthèse du PG de C. difficile, un domaine de recherche encore négligé chez cette bactérie. Étant donné que la synthèse de la paroi cellulaire est l'une des cibles antibiotiques les plus importantes, une meilleure compréhension de la biologie de la paroi cellulaire de C. difficile pourrait aider à mettre au point des procédures pour surmonter la résistance aux antibiotiques de cette bactérie et à identifier de nouvelles cibles médicamenteuses pour l'éradication spécifique de C. difficile. A terme, les principes fondamentaux issus de ce travail auront des implications plus larges que la recherche sur C. difficile et amélioreront considérablement notre compréhension actuelle du contrôle et de la dynamique de la biosynthèse du PG.