Comprendre le mode d'action d'un facteur de transcription pionnier pendant le développement des nodosités symbiotiques – PIOSYM

Dans les noyaux eucaryotes, l'ADN génomique est compacté en s’enroulant autour de tétramères d'histone appelés nucléosomes. La plupart des facteurs de transcription (FT) sont incapables de se lier à leurs séquences cibles en présence de nucléosomes. Cependant, un groupe de FT appelé «pionnier» possède la capacité particulière de se lier à des régions de chromatine inactives, modifiant ainsi leur accessibilité, directement ou via le recrutement de remodeleurs de chromatine. Ces modifications du « paysage chromosomique » par les FT pionniers permettent ensuite à d'autres FT spécifiques de se lier. Par conséquent, les FT pionniers sont des déterminants importants du devenir cellulaire chez les animaux. Dans les plantes, les FT pionniers sont à peine décrits. Les plantes légumineuses telles que Medicago truncatula peuvent interagir avec des bactéries fixatrices d'azote appelée rhizobia. Cette interaction symbiotique conduit à la formation sur les racines de la plante hôte d'un nouvel organe appelé le nodule, à l'intérieur duquel l'azote atmosphérique est fixé au profit de la plante. Le FT NF-YA1 appartenant à la famille des « CCAAT-box binding factors » contrôle spécifiquement le développement des nodules. L’objectif de ce projet est de démontrer que NF-YA1 fonctionne comme un FT pionnier pour réguler la transition développementale entre racine et nodule et pour comprendre son mode d’action. Le projet sera organisé en 3 Work packages (WP) visant à démontrer différents aspects de l'activité pionnière de ce FT. Dans le WP1, nous évaluerons la capacité de NF-YA1 à réguler l’accessibilité à la chromatine, la méthylation de l’ADN et l’organisation en boucle 3D de la chromatine, caractéristiques des FT pionniers. Nous allons a) utiliser une technique appelée ATAC-seq (dosage de la chromatine accessible par transposase suivie de séquençage) pour évaluer l'occupation des nucléosomes dans les nodules mutants WT et nf-ya1-1; b) estimer la méthylation de l'ADN, à l'échelle du génome, en utilisant le BS-seq (conversion bisulfite suivie de séquençage) à nouveau dans les nodules mutants WT et nf-ya1-1 ; et c) appliquer des approches de capture de la conformation chromosomique pour estimer le rôle de NF-YA1 sur la topologie de la chromatine dans les nodules. Dans le WP2, nous identifierons et caractériserons les modificateurs de chromatine potentiels interagissant avec NF-YA1. Nous effectuerons tout d’abord des expériences d’IP/MS (immunoprécipitation suivie de spectrométrie de masse). Alternativement, nous établirons des techniques de marquage basées sur la turbo ID, afin de rechercher des interactions protéine-FT transitoires ou plus faibles. Comme il a déjà été démontré que les protéines DELLA interagissent avec les complexes NF-YA1, l’implication de cette interaction sur l’accessibilité à la chromatine sera également testée, de même que la coopération de NF-YA1 avec un autre type de TF pionnier potentiel lié à la signalisation des cytokinines. Des interactions sélectionnées seront confirmées in planta par le biais de tests BiFC (complémentation de fluorescence bimoléculaire) ainsi que FRET / FLIM (transfert d'énergie de fluorescence / imagerie de durée de vie fluorescente). Le WP3 est consacré à l'identification et à la caractérisation d'ARN longs non codants (lncARN) régulant potentiellement NF-YA1. Une combinaison d'approches ouvertes et ciblées sera également utilisée pour a) isoler des molécules d'ARNnc interagissant avec NF-YA1 à l'aide d'expériences RIP (immunoprécipitation d'ARN) sur des nodules isolés et b) valider des interactions sélectionnées de NF-YA1 avec des ARNnc co-régulés à l'aide du TriFC (complémentation de fluorescence tri moléculaire). Ces résultats démontreront l’impact de NFA1 sur la reconfiguration du paysage épigénétique lors de la transition développementale racine-nodule. Au final, ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le mode d’action novateur d’un facteur de transcription pionnier chez les plantes.