Résaux neuronaux homotypiques du contrôle respiratoire – HOMORESP

Nous allons déchiffrer l'anatomie fonctionnelle de la "formation réticulée" du tronc cérébral inférieur, au niveau cellulaire, en nous concentrant sur les circuits respiratoires et leur nécessaire coordination avec les circuits non respiratoires. Nous avons montré précédemment que de nombreux neurones respiratoires se répartissent en deux grand types, chacun défini par un facteur de transcription : i) le gène pan-autonomique Phox2b (pour les neurones respiratoires homéostatiques et ceux de la commande motrice des muscles orofaciaux ) ; et ii) le gène Dbx1 (pour le pacemaker respiratoire et ceux de la commande motrice de la pompe respiratoire). Les neurones Phox2b et Dbx1 forment de nombreuses synapses Phox2b>Phox2b et Dbx1>Dbx1, donc "homotypiques". Ces observations inspirent les outils et les questions du présent projet :
1) Nous dévoilerons la diversité des types neuronaux au sein des populations respiratoires Phox2b et Dbx1 par transcriptomique sur cellule unique, sur des neurones triés à partir de cerveaux tous les neurones Phox2b+ ou Dbx1+ sont fluorescents et nous classerons les populations neuronales par une analyse bioinformatique et les localiserons par détection de marqueurs in situ. Ce sera le premier effort de ce type, à notre connaissance, pour anatomiser cette partie cruciale du système nerveux central avec cette technologie ;
2) Nous tracerons la connectivité des neurones Dbx1 et Phox2b - incluant leurs connexions "homotypiques" - par une combinaison de techniques: i) des virus de la rage monosynaptiques rétrogrades, injectés dans les muscles orofaciaux ou dans le tronc cérébral complémentés par des virus auxiliaires ou ii) des virus de la rage monosynaptiques rétrogrades complémentés par un transgène conditionnel; iii) un nouvel outil transgénique intersectionnel, qui marque les boutons synaptiques de neurones génétiquement définis par l’expression de deux gènes. En combinant ces techniques, nous explorerons plusieurs niveaux de connectivité au sein des circuits respiratoires, en particulier ceux qui pourraient expliquer la coordination, chez les vertébrés terrestres, de la respiration avec des activités orofaciales non respiratoires (mastication, déglutition, vocalisation, etc...), assurant aussi bien le "primat de la respiration" sur ces activités que la capacité de ses activités à la suspendre temporairement:
i) Cartographie de tous les inputs directs sur le pacemaker respiratoire (le « complexe de préBötzinger »), y compris une projection supposée depuis le « complexe post-inspiratoire »;
ii) Établissement de la matrice de connectivité des neurones prémoteurs de la "formation réticulaire intermédiaire" sur les motoneurones orofaciaux, qui pourrait expliquer la coordination des activités orofaciales avec la respiration.
iii) Recherche du niveau hiérarchique immédiatement supérieur aux neurones prémoteurs orofaciaux (y compris les putatifs générateurs rythmiques de la "formation réticulée intermédiaire"), et des inputs sensoriels directs sur ces neurones prémoteurs.
3) Dans un troisième objectif, nous exploiterons les données transcriptomiques obtenues dans le premier objectif par une deuxième série d'analyses bioinformatiques ad hoc, en cherchant la possibilité que l’uniformité génétique des neurones respiratoires (formant des circuits Phox2b ou Dbx1 « homotypiques ») soit causale dans l'établissement de la connectivité. Nous mettrons en œuvre diverses techniques (analyses par composantes indépendantes, factorisation matricielle non négative et approche bayésienne de l'analyse d'expression différentielle monocellulaire) pour rechercher des modules génétiques communs aux neurones Phox2b (ou Dbx1) qui sont connectés entre eux, et non exprimés dans les neurones qui ne le sont pas. Nous pourrions ainsi découvrir un lien original entre le monde des facteurs de transcription et la formation des circuits.