Analyse de la connectivité fonctionnelle in vivo par ciblage optique et moléculaire – HOLOPTOGEN

La relation entre fonction et connectivité des circuits corticaux est un thème de longue date en neurosciences. Bien que les voies prédominantes du traitement de l’information corticale dans la région sensorielle primaire aient été décrites, on sait peu de choses sur la manière dont la sélectivité du stimulus est construite selon le nombre et la force des connexions synaptiques au sein et entre les couches corticales. De récentes études montrent une corrélation entre probabilité/poids des connexions excitatrices horizontales et préférence du stimulus à la couche, L2/3, du V1 de la souris. Pour examiner à quel point cette connectivité fonctionnelle est généralisée pour les connexions verticales et la comparer aux horizontales, il faut pouvoir mesurer et manipuler l'excitabilité neuronale dans un volume 3D avec une résolution unicellulaire et une précision de l’ordre de la milliseconde (ms).
L'approche classique consistant à insérer plusieurs microélectrodes pour enregistrer et stimuler la carte de la connectivité ne peut toutefois pas être appliquée à des dizaines à centaines de neurones in vivo. Pour remplacer la pipette de patch par la lumière, les récents développements en optogénétique, optique et biologie moléculaire offrent des solutions prometteuses pour étudier le câblage fonctionnel cortical avec la précision spatio-temporelle requise. Nous visons à découvrir les modèles de connectivité sous-jacents au traitement visuel en V1 grâce à l’expertise complémentaire de 2 équipes partenaires: les méthodes de modulation du front d’onde (VE Lab) et la conception d’actuateurs optogénétiques (PH Lab).
Notre approche holographique de modulation de la lumière a prouvé sa capacité à contrôler la génération du potentiel d’action (AP) à l’échelle de la ms via l’excitation 2 photons (2P) in vitro et in vivo. L'utilisation d'opsine ciblée sur les soma garantit une activation à la résolution unicellulaire. Afin d'étendre ce contrôle de l’activité neuronale en profondeure, nous adapterons les paramètres optiques et moléculaires pour l'imagerie et la stimulation 2P jusqu'à ˜1mm de profondeur du cerveau de façon non invasive. Pour évaluer une combinaison opsine/rapporteur d'activation avec un crosstalk minimal, nous testerons des opsines customisées avec différents spectres d'absorption, cinétiques et ciblage membranaire associées à des indicateurs de calcium ou de voltage dans un système optique basé sur notre dernier schéma d’holographie 3D. Pour contrer la perte d'intensité lumineuse due à la diffusion tissulaire, nous optimiserons d'une part les stratégies optiques de sous-remplissage de la pupille de l’objectif, focalisation temporelle et structuration de la lumière, et d'autre part testerons les avantages des opsines ou rapporteurs décalés vers le rouge.
Contrairement aux précédentes études de corrélation entre sélectivité de l'orientation déterminée in vivo et connectivité identifiée in vitro, nous proposons ici de sonder le câblage fonctionnel, in vivo via l'approche optique. Nous tracerons ainsi les connexions monosynaptiques via une illumination holographique sur un neurone présynaptique exprimant une opsine somatique tout en surveillant le potentiel excitateur postsynaptique (EPSP) via une électrode de patch. En déplaçant séquentiellement les spots holographiques sur les neurones à travers les couches corticales, nous pourrons identifier les connexions horizontales et verticales relatives au neurone postsynaptique. Notre méthode permet la génération en ms d’un seul PA dans un neurone présynaptique, permettant ainsi de déterminer la connexion monosynaptique via la latence EPSP. De plus, la lecture d'activité via un indicateur de voltage permettra une cartographie de la connectivité tout optique, avec la capacité de résoudre la directionnalité des connexions neuronales. Nous corrèlerons les préférences de sélectivité avec les probabilité et force de connexion, pour mieux comprendre la transformation du signal au niveau cortical.