Cycle cellulaire et contrôle temporel de la neurgenèse – ETIN-CC

Pour réaliser ces travaux, nous avons utilisé deux modèles classiques d’étude du développement embryonnaire : le poulet et la souris. L’embryon de poulet, de par son accessibilité dans l’œuf, offre l’avantage de pouvoir filmer en temps réel le comportement des cellules; c’est aussi un modèle facile à utiliser pour réaliser des expériences de suivi des cellules et de leur descendance, de perte ou de surexpression d’un gène et qui peut être obtenu en grande quantité pour les analyses grande échelle. La souris offre la possibilité d’utiliser des mutants murins des gènes d’intérêt. Sur ces deux modèles, nous disposons déjà d’une bonne connaissance des mécanismes de neurogenèse (naissance des neurones) y compris de l’évolution temporelle du mode de division des progéniteurs neuraux essentielle pour notre étude. Nous avons réalisé cette étude sur la région caudale du tube neural d’embryon de poulet et de souris, future moelle épinière et au cours du développement du néocortex chez la souris.

Pour atteindre nos objectifs, plusieurs approches complémentaires ont été mises en œuvre :

A l’échelle cellulaire, nous avons mis au point sur l’embryon de poulet, une technique de marquage des 4 phases du cycle cellulaire associée à une technique d’imagerie par microscopie permettant de mesurer en temps réel la durée de chaque phase du cycle cellulaire et le devenir des cellules issues de la division (progéniteurs ou neurones).

A l’échelle moléculaire, nous avons réalisé des analyses globales visant à identifier l’ensemble des gènes dont l’expression est modifiée en réponse à l’activité de CDC25B. Cette analyse nous a permis de poser l’hypothèse que la synthèse des protéines pouvait être modifiée en aval de CDC25B et nous a conduit à mettre au point des stratégies pour la mesurer. Enfin nous avons adapté une technique récente permettant d’identifier des interacteurs de CDC25B avec la perspective de trouver de nouveaux substrats de l’enzyme.

Chez la souris, nous avons étudié les conséquences de la perte de fonction de CDC25B sur le développement du néocortex grâce à un mutant que nous avons généré.

La collaboration avec notre partenaire, nous a permis d’élaborer un modèle mathématique afin de déterminer si les progéniteurs neuraux constituent une population homogène avec un MoD aléatoire, ou une population hétérogène au sein de laquelle les progéniteurs issus d'une division PN perdraient leur capacité proliférative et ne produiraient que des divisions PN et NN, mais plus de PP. Nous avons réalisé des estimations clonales théoriques et des analyses clonales expérimentales pour discriminer ces deux modèles.

Cette étude nous a permis d’obtenir des résultats originaux concernant le contrôle de la transition entre un progéniteur neural en prolifération et un neurone en différenciation qui a arrêté de proliférer, une étape clef pour le développement d’un système nerveux fonctionnel. Nous montrons que dans le tube neural, ébauche embryonnaire de la moelle épinière, les progéniteurs neuraux qui continuent de proliférer sont déjà engagés dans un nouveau cycle cellulaire dès la sortie de mitose. Notre hypothèse est que la décision de continuer à proliférer est prise avant même la division, possiblement au cours de la phase G2 de la cellule mère. Notre stratégie d’imagerie en temps réel révèle que la phosphatase CDC25B, active en phase G2 du cycle cellulaire, induit de façon indirecte l’allongement de la phase G1 des progéniteurs neuraux. Le rallongement de la phase G1 est une caractéristique générale associée à la maturation et différenciation des cellules souches et progénitrices. CDC25B, dont l’expression dans les progéniteurs neuraux est corrélée à la neurogenèse, induirait un raccourcissement de la phase G2 et indirectement un allongement de la phase G1 promouvant ainsi la transition d’un progéniteur en prolifération vers un neurone en différenciation. Ces données révèlent un nouveau mécanisme de rallongement de la phase G1 associé à la différenciation cellulaire au cours du développement d’un organe. Pour aller plus loin dans la compréhension de ce mécanisme, nous avons identifié les gènes modifiés en aval de CDC25B et montré que la machinerie de la synthèse de nouvelles protéines est rapidement stimulée en réponse à l’activité de la phosphatase. Le cycle cellulaire pourrait ainsi contrôler la temporalité de la neurogenèse en modulant la synthèse de protéines essentielles à la différenciation neuronale. Nous avons également établi avec notre partenaire un modèle mathématique de développement du tube neural, en particulier de la genèse des neurones moteurs spinaux permettant de proposer de nouvelles hypothèses pour la production de cette population neuronale.

Enfin l’étude du développement du néocortex chez un mutant CDC25B de souris révèle que la phosphatase est également impliquée dans la neurogenèse corticale, plus spécifiquement dans la maturation des progéniteurs neuraux corticaux.

L’ensemble de ces résultats constitue un apport important quant à la compréhension des mécanismes qui régissent le contrôle de la balance prolifération-différenciation des progéniteurs neuraux pouvant probablement s’appliquer au développement d’autres organes.

Dans la moelle épinière se différencient les neurones moteurs, une population dont la survie est affectée dans de nombreuses pathologies comme par exemple la maladie de Charcot. Un des enjeux des recherches actuelles est de générer des neurones moteurs à partir de cellules souches humaines issues de malades. L’objectif est de disposer de quantités suffisantes de matériel pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le processus de mort neuronale mais également de tester des stratégies thérapeutiques pour favoriser leur survie. Dans cette perspective, les connaissances des mécanismes qui contrôlent la balance prolifération/différenciation des cellules souches/progénitrices objet de cette étude sont clairement d’intérêt.

Des dérégulations de CDC25B sont associées à de nombreux cancers. Les données obtenues sur nos modèles embryonnaires nous ont conduit à initier un programme visant à étudier l’impact de CDC25B sur la durée de la phase G1 dans les glioblastomes.

Enfin, nous avons été contactés par une équipe de généticien ayant identifié une mutation dans le gène CDC25B chez l’humain donnant à l’état homozygote un phénotype marqué de microcéphalie avec retard mental. Nous avons établi une lignée murine reproduisant cette mutation. Des résultats préliminaires indiquent que cette souris pourrait présenter un phénotype de microcéphalie et représenter un nouveau modèle d’étude d’une pathologie associée à un défaut du neurodéveloppement.

La temporalité de la transition entre un progéniteur neural en prolifération et un neurone est critique pour le développement embryonnaire et l’homéostasie du système nerveux des Vertébrés. Une différenciation prématurée entraine une déplétion trop rapide du pool de progéniteurs souvent associée à des maladies du neurodéveloppement. Notre hypothèse est que la machinerie du cycle cellulaire joue le rôle d’horloge de cette transition. Les travaux du partenaire 1 ont identifié le régulateur du cycle cellulaire, la phosphatase CDC25B, comme un facteur de maturation des progéniteurs neuraux induisant les divisions différenciatives, asymétriques neurogéniques (PN) et symétriques terminales (NN) par deux mécanismes moléculaires distincts encore non élucidés. Notre objectif est de combiner une nouvelle stratégie d’imagerie du vivant, des approches transcriptomique et protéomique, des analyses fonctionnelles et de la modélisation mathématique pour élucider ce nouveau mécanisme d’horloge moléculaire.

Le projet est divisé en trois objectifs :

1)Décrypter le rôle du cycle cellulaire dans les divisions NN induites par CDC25B.
CDC25B promeut les divisions NN de façon CDK-dépendante et ceci est corrélé avec un allongement de phase G1. Nous allons : i) déterminer si l'allongement de phase G1 est causal à la fonction de CDC25B sur les divisions NN (outils pharmacologiques et génétiques); ii) comparer les réseaux moléculaires modifiés en aval de CDC25B et suite à une modification de longueur de G1 (RNAseq) ; à partir des réseaux moléculaires modifiés en aval de CDC25B et/ou de l'allongement de G1, identifier et tester fonctionnellement les mécanismes moléculaires favorisant les divisions neurogéniques terminales.

2)Disséquer la fonction de CDC25B dans la production des divisions PN.
Une forme de CDC25B n’interagissant pas avec CDK (CDC25BCDK-) favorise les divisions PN et induit un mouvement nucléaire basal rapide en G1, ce qui implique un nouveau substrat. Nous allons i) identifier de nouveaux substrats de CDC25B par une approche protéomique et les valider fonctionnellement ; ii) définir le lien causal entre localisation sub-cellulaire de CDC25B et sa fonction neurogénique (HA-CDC25B CRISPR/Cas9; CDC25B-GFP); iii) déterminer si l’accélération du mouvement du noyau est responsable du changement de mode de division (MoD) (outils pharmacologiques et forme dominante négative d’un moteur moléculaire); utiliser les données du RNAseq pour identifier les réseaux moléculaires modifiés en aval de CDC25BCDK-.

3)Déterminer si la population de progéniteurs est homogène avec MoD stochastique ou hétérogène avec MoD restreint.
Nos données suggèrent que l'expression de CDC25B dans les progéniteurs neuraux agit comme un facteur de maturation, induisant un passage progressif des divisions prolifératives (PP) aux divisions neurogéniques (PN, NN). Le scénario prédominant est que les progéniteurs neuraux constituent une population homogène avec un MoD stochastique, mais nos données remettent en question cette homogénéité. Le travail théorique effectué par le partenaire 2 soutient une hypothèse alternative où les progéniteurs issus d'une division PN perdent leur capacité proliférative et peuvent ensuite produire uniquement des divisions PN et NN, mais plus de PP. Les résultats préliminaires de la modélisation indiquent que les deux modèles peuvent être discriminés lorsqu'on considère la distribution du ratio progéniteurs/neurones dans les clones. Nous effectuerons des estimations clonales théoriques et les comparerons à des analyses clonales expérimentales pour discriminer entre ces modèles. Les données obtenues à partir des deux premiers objectifs alimenteront également le modèle.

Notre projet devrait permettre de découvrir un nouveau mécanisme de contrôle de la transition entre le maintien et la différenciation des progéniteurs neuraux, qui sera très probablement applicable à d'autres cellules souches, y compris les cellules souches neurales humaines.