Contribution des couches cellulaires au développement des pétales de Petunia hybrida – FLOWER-LAYER

Pour identifier les gènes régulés par PhDEF dans l'épiderme et le mésophylle, il faut pouvoir séparer ces deux couches (et même les différents types de cellules du pétale). Il est assez difficile de séparer physiquement les couches du pétale (on peut les peler mais il y a beaucoup de contamination entre tissus), et nous avons plutôt choisi d'utiliser une technologie récente qui consiste à séquencer le transcriptome de cellules isolées (séquençage du transcriptome en cellule unique, ou single-cell RNA-Seq en anglais). Les cellules végétales sont jointives par leur paroi cellulaire, il faut donc digérer cette paroi pour libérer les cellules, qu'on appelle alors des protoplastes. Ces protoplastes vont passer dans de petits capillaires où ils vont rencontrer différents réactifs pour leur rajouter des sortes de code-barres, qui vont identifier chaque protoplaste de manière unique. Enfin, les transcrits (gènes qui sont exprimés, c'est-à-dire lus par la cellule) de chaque cellule sont identifiés par séquençage. On obtient donc, pour chaque cellule, le niveau d'expression (quantité) de chacun des gènes du génome de pétunia. Par des méthodes bio-informatiques, on arrive à grouper les cellules les plus similaires entre elles et à retrouver de quelle zone du pétale elles proviennent (Illustration 2, chaque point représente une cellule, dans un espace qui représente les gènes qu'elle exprime). Ainsi, pour chaque type de cellule du pétale, on sait quels sont les gènes exprimés, et potentiellement quels sont les gènes régulés par PhDEF.

En parallèle, nous avons également déterminé quelles sont les régions d'ADN liées par PhDEF par une méthode d'immunoprécipitation de la chromatine. Pour cela, l'ADN du pétale est fragmenté en petits morceaux, puis incubé avec un anticorps qui reconnait la protéine PhDEF. On peut isoler ces anticorps liés à la protéine, elle-même liée à l'ADN, et séquencer cet ADN. Ceci nous donne donc l'identité des fragments d'ADN spécifiquement liés par la protéine PhDEF, et donc potentiellement les gènes dont l'expression est régulée par PhDEF.

En croisant ces deux types de données (séquençage du transcriptome en cellule unique, et immunoprécipitation de la chromatine), on obtient une liste de gènes cibles de PhDEF dans les différentes cellules du pétale, et donc dans ses différentes couches cellulaires.

Nos données nous ont appris plusieurs choses :

- de manière générale, l'épiderme du pétale exprime plus de gènes spécifiques (c'est-à-dire exprimés exclusivement ou beaucoup plus fortement dans l'épiderme que dans le mésophylle) que le mésophylle ;

- PhDEF régule l'expression de plus de gènes dans l'épiderme que dans le mésophylle ;

- les gènes cibles de PhDEF dans l'épiderme participent à des fonctions de pigmentation, de formation de la cuticule ou de croissance. Les rares gènes cibles de PhDEF dans le mésophylle ont des fonctions moins bien caractérisées pour le moment.

Ainsi, nos résultats pointent vers une identité "épiderme" activement déterminée par PhDEF, alors que l'identité "mésophylle" semble être une identité par défaut, probablement similaire au mésophylle d'un sépale. De manière générale, nos approches ont permis d'obtenir des données quantitatives et qualitatives sur les réseaux de gènes impliqués dans la spécification de l'identité du pétale, au niveau de chacune de ses couches cellulaires.

Ces résultats nous ont amené vers une nouvelle question. En effet, nous avons montré que PhDEF régule des gènes cibles différents au niveau de l'épiderme et du mésophylle du pétale. Pourtant, nous savons que PhDEF est exprimé de manière comparable au niveau de ces deux couches. Comment, à partir de l'expression homogène du même gène, peut-on aboutir à 2 réseaux de régulation de gènes différents ?

Nous envisageons maintenant 2 hypothèses non exclusives :

- PhDEF a des partenaires protéiques différents dans l'épiderme et dans le mésophylle. En effet, la famille de protéines à laquelle PhDEF appartient est connue pour fonctionner en complexes de protéines (dimères ou tétramères). L'association avec des partenaires différents peut modifier la spécificité de liaison à l'ADN du complexe, c'est-à-dire que PhDEF reconnaîtrait des cibles ADN différentes en fonction de son partenaire, et régulerait donc des gènes différents. Nous allons maintenant identifier les partenaires de PhDEF dans les deux couches du pétale par une technique de co-immunoprécipitation.

- l'accessibilité de l'ADN est différente dans l'épiderme et le mésophylle. En effet, il est connu que les gènes peuvent être dans des régions plus ou moins accessibles (ADN plus ou moins compacté, ou recouvert de protéines). Si l'accessibilité de l'ADN étaient différente dans l'épiderme et le mésophylle, PhDEF pourrait accéder à certaines régions de l'ADN dans l'épiderme qui ne sont pas accessibles dans le mésophylle, et vice-versa. Nous allons donc tester si l'accessibilité de gènes spécifiques de l'épiderme ou du mésophylle est différente dans ces deux couches cellulaires, par un technique de digestion modérée de l'ADN.

L'exploration de ces deux hypothèses nous permettra de mieux comprendre comment un même gène remplit des rôles très différents dans des contextes cellulaires différents.

Comment les cellules coordonnent leur croissance pour produire des organes aux formes bien définies est une question essentielle de la biologie du développement. Les organes des plantes sont organisés en couches cellulaires distinctes qui ne se mélangent pas au cours du développement. L'identité, la forme et la taille des organes sont spécifiés par des régulateurs maîtres. L’objectif général du projet est de comprendre comment un gène maître peut contrôler la croissance coordonnée des différentes couches cellulaires d’un organe, assurant par-là même l'acquisition robuste d'une identité, d'une taille et d'une forme propre à chaque organe. Pour cela nous utiliserons les fleurs de Petunia hybrida, dont les pétales sont organisés en un tube se terminant en lobes colorés. Nous avons obtenus des fleurs chimères chez cette espèce, qui dérivent de l'excision spécifiquement dans une couche cellulaire d'un transposon inséré dans le gène PhDEF, un gène à boîte MADS contrôlant le développement des pétales. Ces chimères révèlent que l'expression de PhDEF dans l'épiderme du pétale spécifie la croissance des lobes, alors que son expression dans les couches internes du pétale spécifie la croissance du tube. Ceci suggère que le tube et les lobes constituent deux modules développementaux indépendants, dont la croissance est contrôlée de manière couche cellulaire-spécifique. De plus, nos résultats suggèrent l'existence d'effets non-cellule-autonomes entre couches cellulaires, puisque l'expression de PhDEF dans les couches internes du pétale est suffisante pour spécifier une partie de l'identité de type pétale au niveau de l'épiderme.

L'objectif de ce projet est de caractériser le réseau de régulation contrôlé par PhDEF dans les fleurs de Petunia hybrida, de manière couche cellulaire-spécifique, pour comprendre comment PhDEF peut diriger la croissance du tube ou des lobes indépendamment depuis des couches cellulaires distinctes. Pour cela, après une caractérisation détaillée des fleurs chimériques que nous avons obtenues, nous allons recréer ces chimères sous forme de plantes transgéniques. Ceci nous permettra d'identifier les cibles et les interacteurs de PhDEF spécifiquement pour chaque couche cellulaire, en utilisant une combinaison d'approches de tri cellulaire, RNA-Seq, ChIP-Seq et coimmunoprécipitation. Nous allons aussi identifier les cibles non-autonomes de PhDEF, induites dans une couche cellulaire par l'expression de PhDEF dans une autre couche cellulaire. Enfin nous allons caractériser la fonction de quelques gènes cibles clés de PhDEF, pour comprendre comment ils peuvent diriger la croissance du tube ou des lobes de manière couche cellulaire-spécifique. Dans l'ensemble ce projet devrait représenter une forte avancée pour la biologie du développement des plantes, en cherchant à comprendre comment un gène régulateur maître peut diriger la croissance et l'identité des organes dans toutes les couches cellulaires de manière coordonnée.