Nucleation d’actine sous controle dévelopmental chez C. elegans. – DeCaNu

Nous nous sommes concentrés sur quatre protéines de liaison à l'actine connues pour être essentielles à la régulation de la dynamique de l'actine : deux nucléateurs d'actine qui induisent la polymérisation des filaments, une protéine de coiffe qui bloque l'élongation et une protéine présente aux jonctions cellulaires. Pour quantifier la concentration de ces protéines et comparer les contenus cellulaires au sein d'un même embryon, nous avons réalisé des acquisitions par microscopie d’embryons de C. elegans du stade d'une cellule à six cellules, exprimant des protéines de liaison à l'actine couplées à un fluorophore. Des méthodes d'analyses semi-automatiques ont été développées pour suivre dans l'espace et le temps la distribution relative des protéines à chaque division cellulaire.
L'actine en tant que telle n'était pas accessible en utilisant une telle stratégie, car son couplage à une protéine fluorescente entraîne une létalité embryonnaire chez C. elegans. Nous avons donc développé de nouvelles stratégies pour libérer le contenu cytoplasmique d'une seule cellule sous le microscope. Cette stratégie a permis de repolymériser l'actine dans un environnement contrôlé plus large et permettant le marquage de l'actine, afin d'effectuer des mesures quantitatives telles l'abondance des filaments ou la vitesse d'élongation de ceux-ci. Ces expériences in vitro ont permis d'estimer l'abondance de l'actine dans chaque cellule afin d'évaluer leurs capacités de polymérisation respectives.

Nous avons révélé que les divisions cellulaires rapides et successives de C. elegans, du stade 1 à 4 cellules, ne divisent pas de manière égale les protéines liées à l'actine, ce qui entraîne une diversité du contenu du cytosquelette dans chaque cellule. Nous avons confirmé que les divisions asymétriques sont corrélées à des asymétries d'actine, mais des différences apparaissent également dans une division décrite comme symétrique. De plus nous avons identifié une lignée, la lignée germinale, qui se trouve activement déplétée en filaments d'actine. Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives quant au rôle joué par l'actine lors de l'acquisition de l'identité cellulaire dans l'embryon précoce.

Nos données suggèrent que des gradients de concentration de protéines de liaison à l'actine et diffusant librement dans le cytoplasme peuvent exister de manière similaire aux gradients déjà décrits pour les protéines liées à la membrane. Ces gradients sont en corrélation avec la quantité de protéines activement recrutées au niveau du plan cortical de la cellule. De plus, nous avons vu que ces distributions contrôlées spatio-temporellement peuvent être héritées dans les cellules filles. Par conséquent, ces asymétries pourraient amplifier les différences entre les cellules en termes de dynamique d'assemblage de l'actine le long de la lignée de l'embryon précoce de C. elegans. Nous avons notamment révélé que la lignée germinale (cellules P1 et P2) est fortement appauvrie en filaments d'actine par rapport aux cellules voisines. Un résultat surprenant de notre travail est l'asymétrie précoce observée dans les cellules filles de AB, ABa et ABp. Cela signifie des voies de signalisation plus précoces que connues provenant de l'interaction directe P2 et conduisant à la différenciation de la cellule ABp. En d'autres termes, la distribution asymétrique des protéines liées à l'actine peut précéder la différenciation cellulaire dans ce contexte cellulaire. D'autres expériences de perturbation utilisant l'épuisement partiel par RNAi ou utilisation de mutants devront être réalisées pour déchiffrer le mécanisme à l'œuvre expliquant ces différences.

L’ensemble de la production scientifique obtenue au cours de ce projet a permis à mon équipe nouvellement créée de développer de nouvelles thématiques de recherches, de développer de nouveaux protocoles expérimentaux et ainsi démarrer deux nouvelles collaborations. La valorisation via publications scientifiques est aboutie pour ces projets collaboratifs, l’article scientifique décrivant la plus grande partie des résultats est toutefois encore en cours de finalisation en vue d’une soumission dans les mois à venir.

Si l’architecture du cytoskelette est en partie dictée par l’état de la cellule, l’inverse est également vrai. Les réseaux d’actine, en contrôlant la morphologie de la cellule, sa mécanique, ou même directement l’expression de certains gènes, influencent également l’état de la cellule et ses capacités d’interaction avec l’environnement. Ceci est d’autant plus important dans un organisme en développement, où chacune des différentes cellules doit acquérir une identité et une place spécifique à sa fonction. Le but de cette proposition est de révéler comment la nucléation des architectures d’actine est spatio-temporellement contrôlée dans les blastomères de l’embryon précoce de C. elegans et comment cela affecte leur devenir.

Nous caractériserons les architectures spécifiques d’actine contenues dans les cellules de l’embryon précoce afin de définir des identités cytoskeletales en lien avec le lignage de celle-ci. D’une part en quantifiant les niveaux d’expressions et la dynamique des nucléateurs d’actine marqués de manière endogène par une GFP, ce qui nous permettra d’établir un lignage moléculaire. D’autre part, en utilisant une approche biochimique plus in vitro dans un environnement contrôlé. Pour ce faire nous développons un système qui nous permettra de produire des extraits moléculaires de cellules uniques et d’utiliser ce contenue comme substrat pour la nucléation d’actine in vitro sur micropatrons contrôlés. Finalement nous procéderons à une série de perturbations ; soit de la dynamique de l’actine en quantifiant les différents états cellulaires, soit vice versa, en modifiant l’état cellulaire et quantifiant la dynamique de l’actine. Ceci afin de tester les interactions entre identité cellulaire et dynamique de l’actine dans un embryon en développement.

Ce projet nous apportera une nouvelle vision de la régulation spécifique de la dynamique de l’actine dans une situation naturelle où les cellules se différencient rapidement au cours du lignage précoce. Cela nous permettra de mieux cerner comment la biochimie de l’actine est contrôlée in vivo et contribue de manière active au développement d’un organisme.