Contrôle épigénétique de l’activité des transposons et l’empreinte génomique chez les graines hybrides – EpiHYBRIDS

1. Profilage des petits ARN et de la méthylation de l'ADN dans le pollen en utilisant les technologies de séquençage d'ARN et de séquençage au bisulfite.

2. Expression de la protéine RNaseIII-like RTL1 d’Arabidopsis dans les deux types cellulaires du pollen, afin d'identifier la source des petits ARN dérivés des éléments transposables impliqués dans le blocage triploïde.

3. Épimutagenèse chez les plantes d'Arabidopsis exposées à l'inhibiteur de méthylation de l'ADN 5-Azacytidine, afin de générer des épimutants ségrégeant des loci hypométhylés.

4. Déméthylation ciblée de l'ADN des loci soumis à l'empreinte épigénétique parentale dans la lignée germinale mâle en utilisant des DNA glycosylases.

Nous avons développé une nouvelle méthode pour identifier les petits ARN (siRNAs) dérivés des éléments transposables (ET) produits dans le pollen, en utilisant une lignée marquée par fluorescence (FTL) génétiquement liée à l'allèle de type sauvage de NRPD1a (gène codant pour la plus grande sous-unité de l'ARN polymérase IV). Cette lignée FTL contenant un marqueur fluorescent exprimé dans le pollen (pLat52::DsRed) a été croisée avec un mutant nrpd1, donnant une plante F1 hétérozygote pour les allèles nrpd1 et FTL et pour laquelle il est possible de purifier le pollen de type sauvage (DsRed +) et nrpd1 (DsRed -) par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Nous avons ainsi pu identifier sur ce matériel des siRNAs dépendants de Pol IV produits activement pendant le développement du pollen. Nous avons ensuite proposé d’analyser l’expression de l’enzyme RNaseIII-like RTL1 dans différents types cellulaires du pollen, car RTL1 dégrade les siRNAs endogènes chez A. thaliana. L'objectif principal de cette expérience était d'identifier la source des siRNAs impliqués dans le blocage triploïde. Différentes lignées transgéniques indépendantes pour les différents constructeurs ont été produites et étudiées pour tester l'effet de RTL1 sur la biogenèse des siRNAs (séquençage et analyse des petits ARN) et sur le blocage triploïde (hybridations interploïdes). Ces analyses ont montré que Pol IV transcrit différents sous-ensembles d'ET dans les deux types cellulaires du pollen, mais que les siRNAs impliqués dans le blocage triploïde sont produits uniquement dans la cellule végétative du pollen.

Pachamuthu K, Simon S, Borges F. Targeted suppression of siRNA biogenesis in Arabidopsis pollen promotes triploid seed viability. Nature Communications (2024)

Nous avons également découvert que l’épimutagenèse chez les plantes d'Arabidopsis exposées à l'inhibiteur de méthylation de l'ADN 5-Azacytidine permet de supprimer le blocage triploïde de manière dépendante de la dose d'inhibiteur. Fait remarquable, les lignées suppressives fortes ont montré une transmission transgénérationnelle stable de l'hypométhylation aux éléments transposables (ET) encadrant les gènes paternels qui sont des cibles bien connues des DNA glycosylases. Nous avons ensuite effectué une déméthylation ciblée de l'ADN au niveau des loci soumis à l'empreinte génétique dans la lignée germinale mâle en utilisant une promoteur spécifiquement exprimé au début du développement du pollen, ce qui a confirmé que l'hyperméthylation des cibles des DNA glycosylases est fonctionnellement associée à un fort blocage triploïde.

Huc J, Dziasek K, Pachamuthu K, Woh T, Köhler C, Borges F. Bypassing reproductive barriers in hybrid seeds using chemically induced epimutagenesis. Plant Cell (2022)

Les résultats obtenus dans ce projet ont fourni une base solide pour de futures recherches visant à mieux comprendre les fondements épigénétiques du blocage triploïde chez A. thaliana. De plus, ce travail a permis de développer des outils moléculaires précis pour surmonter les barrières d'hybridation au niveau des graines, ce qui présente un grand intérêt pour l'amélioration des plantes cultivées. L'identification des siRNAs dérivés du pollen impliqués dans le blocage triploïde, ainsi que des familles spécifiques de ETs qui doivent être hyperméthylées pour établir le blocage triploïde, permettra désormais d'examiner comment cette interaction peut favoriser l'avortement des graines triploïdes chez Arabidopsis et les espèces cultivées.