CE11 - Caractérisation des structures et relations structure-fonction des macromolécules biologiques

Structure et fonction des complexes endogènes contenant TFIID – PICen

Structure et fonction des complexes contenant des TFIID endogènes

La protéine de liaison TATA-box est délivrée aux promoteurs des gènes par le complexe TFIID ou SAGA. Ils ont été suggérés que ces complexes fonctionnent également comme des co-activateurs de transcription en interagissant avec les activateurs de transcription pour nucléer la formation des PIC. La structure des PICs natifs n'est pas connue, ce qui laisse la possibilité que la composition et l'architecture des PICs assemblés in vivo puissent différer de ceux reconstitués in vitro.

Objectifs du projet

Pour mieux comprendre le rôle du TFIID natif dans la formation des PIC endogènes et l'initiation de la transcription qui en découle, nous avons les objectifs suivants : caractériser la façon dont TBP est recruté à l'ADN du promoteur ; caractériser la composition et la structure des PIC endogènes contenant le TFIID ; identifier à l'échelle du génome les promoteurs transcriptionnellement actifs liés par Tafs, TBP, Pol II et GTFs pour définir différentes classes de promoteurs occupées par des PIC distincts contenant le TFIID.

Diverses techniques de purification des protéines
Microscopie électronique cryogénique
Retard sur gel (EMSA ou electrophoretic mobility shift assay)
FRET
XL-MS
Techniques d'immunoprécipitation de la chromatine

Le co-activateur SAGA est une machine moléculaire impliquée dans l’expression des gènes et la différentiation cellulaire. Composé de 19 protéines, SAGA fait le lien entre l’organisation du génome sous forme de chromatine, les voies de signalisation cellulaires et l’initiation de la transcription prélude à la synthèse d’ARN messager. La structure atomique de SAGA obtenue par cryo microscopie électronique illumine ces différentes fonctions et explique comment SAGA interagit avec la protéine TBP et régule son activité d’initiation de la transcription. Ces résultats sont publiés dans la revue Nature.
L’expression des gènes dans les noyaux de nos cellules débute par l’assemblage du complexe de pré-initiation (PIC) de la transcription permettant le positionnement de l’ARN polymérase II au niveau des promoteurs. TFIID, composé de la protéine «TATA binding protein« (TBP) et de 13 protéines associées, reconnaît les séquences promotrices du gène et initie l’assemblage du PIC. Les chercheurs ont étudié un type cellulaire unique dans lequel l’initiation de la transcription ne dépend pas de TFIID : l’ovocyte. Publiés dans la revue Nature Communications, ces travaux mettent en évidence un nouveau complexe qui remplace TFIID/TBP responsable de l’initiation de la transcription au cours de la croissance ovocytaire.

Notre projet de collaboration, basé sur des interactions de longue date entre les partenaires, permettra de découvrir la spécificité des interactions TFIID/TBP-ADN promoteur, comment TBP se comporte pendant l'initiation de la transcription, et si TBP se détache de TFIID pendant la liaison au promoteur in vitro. Notre proposition décrira également la composition des sous-unités et la structure moléculaire des complexes d'initiation contenant TFIID liés au promoteur et assemblés in vivo. Notre nouveau protocole de purification du TFIID natif et des PICs endogènes ouvre la possibilité de déterminer la structure des complexes d'initiation de la transcription natifs ainsi que leur paysage d'interaction. Ces informations, combinées à l'occupation des TAF, TBP, GTF et Pol II à l'échelle du génome et aux ensembles de données sur le profilage de l'expression génétique, permettront d'identifier des ensembles distincts d'assemblages de PIC contenant des TFIID sur différentes classes de promoteurs qui sont impliqués dans l'initiation de la transcription. Ainsi, nos résultats apporteront un nouvel éclairage sur le processus d'initiation de la transcription native en déterminant la composition et la structure des complexes d'initiation clés contenant des TFIID formés dans des cellules vivantes.

Les partenaires 1 et 2 ont publié ensemble :
What do the structures of GCN5-containing complexes teach us about their function? Helmlinger D, Papai G, Devys D, Tora L. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 2021 Feb;1864(2):194614. doi: 10.1016/j.bbagrm.2020.194614. Epub 2020 Jul 31. PMID: 32739556
Partner 1:
1. Papai G, Frechard A, Kolesnikova O, Crucifix C, Schultz P, Ben-Shem A. Structure of SAGA and mechanism of TBP deposition on gene promoters. Nature. 2020 Jan;577(7792):711-716. doi: 10.1038/s41586-020-1944-2. Epub 2020 Jan 22. PMID: 31969704.
2. Papai G, Frechard A, Kolesnikova O, Crucifix C, Schultz P, Ben-Shem A. Atomic structure of the SAGA complex and it's interaction with TBP. C R Biol. 2021 Feb 4;343(3):247-255. doi: 10.5802/crbiol.31. PMID: 33621454.
Partner 2:
1. TBPL2/TFIIA complex establishes the maternal transcriptome through oocyte-specific promoter usage. Yu C, Cvetesic N, Hisler V, Gupta K, Ye T, Gazdag E, Negroni L, Hajkova P, Berger I, Lenhard B, Müller F, Vincent SD, Tora L. Nat Commun. 2020 Dec 22;11(1):6439. doi: 10.1038/s41467-020-20239-4. PMID: 33353944
2. Visualization of Endogenous Transcription Factors in Single Cells Using an Antibody Electroporation-Based Imaging Approach. Conic S, Desplancq D, Ferrand A, Molina N, Weiss E, Tora L. Methods Mol Biol. 2019;2038:209-221. doi: 10.1007/978-1-4939-9674-2_14.

Un contrôle précis de l'expression des gènes eucaryotes lors de la transcription est essentiel pour orchestrer des processus cellulaires fondamentaux. Notre projet vise à découvrir les mécanismes moléculaires qui coordonnent ce processus. Nous proposons d'étudier la composition biochimique et la structure des complexes d’initiation de la transcription formés in vivo par une approche intégrative impliquant la purification des complexes protéiques natifs, la cryo-microscopie électronique, la spectrométrie de masse couplée à du pontage chimique, la cartographie des promoteurs génomiques et les méthodes de profilage transcriptionnel.
La transcription par l’ARN polymérase II (Pol II) des gènes codant pour des protéines est un processus étroitement régulé par des machineries moléculaires multi-composant. L'assemblage du complexe de préinitiation de la transcription (PIC) sur le promoteur des gènes est une étape régulatrice clé pour sélectionner le gène à exprimer et positionner l'enzyme sur le site d'initiation de la transcription. L'assemblage séquentiel du PIC sur un promoteur contenant une séquence TATA a été reconstitué in vitro et implique l'interaction de la protéine TBP avec la séquence TATA, la liaison subséquente de TFIIA et TFIIB qui recrutent Pol II avec TFIIE, TFIIF et TFIIH. Des modèles atomiques du PIC reconstitué in vitro ont été déterminées récemment.
Cependant in vivo TBP est associé à 13 facteurs protéiques (les TAFs) pour former le facteur de transcription IID (TFIID) qui non seulement déclenche la formation PIC, mais fonctionne également comme co-activateur en interagissant avec des activateurs de transcription. D’autres facteurs, tel que le Mediator, TFIIS, les acétyltransférases SAGA et NuA4, ou les remodeleurs de chromatine, contribuent à l'activation transcriptionnelle et à la formation de PIC, ouvrant la possibilité que le PIC assemblé in vitro soit différent de celui formé dans la cellule.
Pour mieux comprendre le rôle du facteur TFIID natif dans la formation du PIC endogène et l’initiation de la transcription qui en résulte, nous avons posé les objectifs suivants :
1) Caractériser comment TFIID se lie à l'ADN promoteur et comment TBP participe à ce processus
2) Caractériser la composition et la structure des PICs endogènes contenant TFIID
3) Décrire lesinteractions entre les sous-unités des PICs contenant TFIID associé à l'ADN promoteur
4) Identifier à l'échelle du génome les promoteurs actifs sur le plan transcriptionnel, ainsi que ceux liés par des Taf, TBP, Pol II et GTF afin de définir différentes classes de promoteurs occupés par des PIC de composition distincte et contenant TFIID
Dans notre projet collaboratif, basé sur des interactions de longue date entre les partenaires, nous découvrirons la spécificité des interactions ADN TFIID / TBP-promoteur et le comportement du TBP lors de l’initiation de la transcription. Notre proposition décrira également la composition en sous-unités et la structure moléculaire des complexes d'initiation contenant TFIID liés au promoteur, assemblés in vivo. Notre nouveau protocole de purification de TFIID natif et de PIC endogènes ouvre la possibilité de déterminer la structure des complexes d'initiation de la transcription natifs ainsi que leur paysage d'interaction. Ces informations, combinées aux ensembles de données de profil d’occupation et d’expression génique TAF, TBP, GTF et Pol II du génome, permettront d’identifier des ensembles distincts d’assemblages PIC contenant TFIID sur différentes classes de promoteurs participant à l’initiation de la transcription. En bon accord, nos données préliminaires indiquent que les CIP natifs diffèrent considérablement de l’assemblage de CIP reconstitué in vitro. Ainsi, nos résultats jetteront un éclairage nouveau sur le processus d'initiation de la transcription native en déterminant la composition et la structure des complexes d'initiation clés contenant TFIID formés dans des cellules vivantes.

Coordinateur du projet

Monsieur Gabor Papai (INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Institute for Systems Biology / Ranish lab
IGBMC INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE
IGBMC INSTITUT DE GENETIQUE ET DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET CELLULAIRE

Aide de l'ANR 473 342 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2019 - 36 Mois

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