Protéines d'ancrage artificielles pour l'ingénierie de voies de biosynthèse de produits naturels – SCAFFOLD-ART

Les alphaReps sont des protéines artificielles constituées par la répétition d'un motif de 31 acides aminés qui forme deux hélices alpha antiparallèles. Chaque motif s'empile sur le précédent. Les alphaReps ont la forme d'un solénoïde incurvé. Ces protéines sont bien repliées, stables et constituent des domaines facilement fusionnés à d'autres protéines. Des bibliothèques importantes et diverses de gènes codant des alphaReps existent. Dans ces protéines, les motifs répétés ont la même séquence sauf à six positions, situées sur la face concave, où une variabilité est introduite. La région concave forme donc une surface hypervariable pour des interactions potentielles. À partir de ces bibliothèques, on peut sélectionner par la technique de phage display des alphaReps liant fortement et spécifiquement des protéines cibles choisies arbitrairement. On génère ainsi des paires composées d'une alphaRep et de sa cible. Ces paires seront utilisées pour construire de nouveaux outils de scaffolding.
Deux types de scaffolding différents seront utilisés. Dans le premier, chaque enzyme de la voie de biosynthèse sera fusionnée à une alphaRep spécifique, qui jouera le rôle de domaine d'adressage. Les cibles de ces alphaReps seront fusionnées pour former une plateforme d’amarrage. Le deuxième type tire parti du fait que les alphaReps peuvent lier d'autres alphaReps. À l'origine, seule la surface concave de l’alphaRep est variable. Mais on peut introduire de la variabilité sur la face convexe, ou arrière, et sélectionner des alphaReps qui lient cette face arrière. Une alphaRep peut donc lier avec son côté concave une cible, qui peut être la surface arrière convexe d'une autre alphaRep, et peut simultanément être liée par sa surface arrière convexe à une alphaRep différente. Cet arrangement peut être récursif et un ensemble de plusieurs alphaReps de ce type devrait s'empiler dans un ordre défini.
Les outils de scaffolding seront utilisés avec des voies de biosynthèse impliquant des cyclodipeptides synthases (CDPS) ou des synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS). Les CDPS sont des enzymes qui utilisent deux aminoacyl-ARNt détournés de leur rôle canonique dans la synthèse ribosomique et catalysent la formation de divers cyclodipeptides. Les CDPS sont associées à des enzymes de décoration, modifiant les cyclodipeptides pour former des dicétopipérazines, une classe de produits naturels aux activités biologiques intéressantes. Les NRPS sont une famille de méga-enzymes microbiennes qui synthétisent leurs produits par la formation de liaisons amide entre des monomères aminoacyle (ou autre acyle). Les NRPS typiques sont organisées en ensembles répétitifs appelés modules. Chaque module est responsable de l’introduction et de l’éventuelle modification d’un monomère. Les différents modules peuvent faire partie d'une seule protéine ou être répartis sur plusieurs protéines qui s'assemblent de manière non covalente.

1. Nouvelles alphaReps
AlphaReps Janus
Des alphaRep capables de reconnaitre d’autres alpha-Reps (alphaReps Janus) ont été sélectionnées afin de réaliser le scaffolding sans plateforme d’amarrage. Pour cela une nouvelle série de cinq protéines alphaReps a été conçue, avec une face arrière convexe ayant une composition distincte des autres alphaReps précédemment construites. Plusieurs interacteurs spécifiques, se liant à la face arrière convexe ont été obtenus pour quatre de ces alphaReps.
Système « brique – agrafe »
La caractérisation de la structure d’un couple constitué d’une alphaRep « cible » et d’une alphaRep « back binder » reconnaissant la face arrière de cette cible a conduit à la conception d’un système de briques et d’agrafe permettant la formation de grandes fibres hélicoïdales d’alphaReps. Pour cela les 3 motifs de l’alphaRep cible ont été scindés et fusionnés à l’extrémité N ou C-terminale d’une autre alphaRep pour constituer une brique. Les alphaRep « back binder » recrutent deux briques pour reconstituer leur cible, agissant comme des agrafes pour former un grand filament d’alphaReps.
Nouvelles alphaReps liant des mini-protéines
Cinq protéines artificielles décrites dans la littérature ont été choisies pour leur petite taille (~50 acides aminés) et leur stabilité conformationnelle. Des alpha-Reps liant ces mini-protéines ont été obtenues.
2. Application aux voies de biosynthèse de dicetopipérazines
Très tôt dans le projet plusieurs couples alpha-Rep/ligand étaient disponibles. Ces couples ont été utilisés pour des essais de scaffolding pour des voies de biosynthèse impliquant des CDPS. Différentes enzymes (amino acyl ARNt synthétases, CDPS, enzymes de modification des cyclodipeptides par exemple transférases de prényle) et différentes configurations de scaffolding ont été testées. Les résultats obtenus n’ont pas permis d’augmenter l’efficacité de ces voies et ont mis en évidence que la fusion de certaines enzymes avec les alpha-Reps ou leurs ligands pouvait avoir des effets délétères sur l’activité enzymatique, en particulier sur celle des CDPS. Ceci a motivé la sélection de nouvelles alphaReps liant des mini-protéines. Ces dernières n’ont pas encore été testées pour le scaffolding des voies de biosynthèse de dicétopipérazines.
3. Test avec une GFP fragmentée
Pour tester facilement les interactions alpha-Rep/ligand in vivo, nous avons construit un système utilisant une GFP fragmentée (split-GFP). Des plasmides ont été construits permettant de cloner facilement les séquences codant les alpha-Reps ou les ligands afin de tester rapidement leur interaction in vivo chez Escherichia coli.
4. Application aux voies de biosynthèse impliquant des NRPS.
La NRPS AusA catalyse la biosynthèse d’aureusimine. AusA est une NRPS classique constituée d’une seule protéine bimodulaire. Les deux modules ont été séparés et des essais de scaffolding ont été effectués pour tenter de rétablir l’activité de AusA. Les expériences sont encore en cours.

Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet montrent bien l’intérêt des alphaReps pour les approches de biologie synthétique en général. Avec les voies de biosynthèse de produits naturels que nous avons utilisées comme modèles d’étude, nous n’avons pas (encore) pu démontrer leur intérêt pour le scaffolding d’enzymes de voie de biosynthèse. Toutefois le système split-GFP que nous avons construit pour tester facilement l’interaction in vivo d’alphaReps avec leur cible devrait permettre d’identifier des couples alphaRep-cible qui fonctionnent bien in vivo pour co-localiser des protéines (expériences en cours). Les couples les plus performants ainsi identifiés seront testés pour le scaffolding d’enzymes de biosynthèse de produits naturels dans les deux types de modèles (voies impliquant des CDPS ou des NRPS).

Jessalyn Miller, Agathe Urvoas, Benoît Gigant, Malika Ouldali, Ana Arteni, et al.. Engineering of brick and staple components for ordered assembly of synthetic repeat proteins. Journal of Structural Biology, 2023, 215 (3), pp.108012. ?10.1016/j.jsb.2023.108012?. ?hal-04210030?
dx.doi.org/10.1016/j.jsb.2023.108012

Les produits naturels (PN) sont de petites molécules bioactives produites par des organismes vivants, souvent des microorganismes. Ils sont à l’origine de nombreux médicaments. La diversité des PN n’a pas été explorée et exploitée de manière exhaustive. Dans de nombreux domaines (anti-infectieux, anti-tumoraux, …) de nouvelles molécules bioactives sont activement recherchées, entre autres parmi les PN. La biologie de synthèse, qui vise à modifier rationnellement les organismes vivants pour leur conférer de nouvelles fonctions, peut contribuer à cette recherche de molécules bioactives. Dans le domaine des PN, la biologie de synthèse peut permettre de découvrir de nouveaux PN en exprimant des groupes de gènes de biosynthèse de PN silencieux dans les conditions de laboratoire, d’améliorer les rendements de biosynthèse ou de synthétiser de nouveaux PN en reprogrammant des chaînes d'assemblage biosynthétiques. Cependant, cette approche en est encore à ses débuts et des outils performants doivent être développés pour faciliter son utilisation.
La biosynthèse des PN implique une succession souvent complexe d'étapes catalysées par des enzymes. Chaque étape peut être réalisée indépendamment des autres. Cependant les enzymes d’une voie métabolique peuvent être organisées dans l'espace afin d'améliorer l'efficacité globale de cette voie. Des approches de biologie de synthèse visent à rapprocher et organiser spatialement dans la cellule les enzymes impliquées dans une même voie. Ceci peut être fait en fusionnant les domaines catalytiques avec des domaines de liaison afin que différentes enzymes se lient à une même molécule (ADN, ARN, protéine). Ces approches de "scaffolding" nécessitent la mise au point d’outils performants, modulaires et faciles à utiliser. Nous proposons d’utiliser une nouvelle famille de protéines artificielles, les alphaRep pour construire de nouveaux outils de "scaffolding". Les alphaRep sont structurées, extrêmement stables, non sujettes à l'agrégation. Elles peuvent donc être facilement fusionnées à d'autres partenaires protéiques. Les AlphaRep ont une forme de solénoïde courbe dont la région concave forme une surface d'interaction hypervariable. Il est possible de sélectionner des alphaRep capable de fixer spécifiquement toute protéine cible, naturelle ou artificielle, arbitrairement choisie. Ceci permet de générer, de manière rapide et efficace, un ensemble de paires de protéines orthogonales, chacune interagissant de manière spécifique avec un unique partenaire. Nous proposons de développer des systèmes orignaux permettant d’organiser spatialement des enzymes de biosynthèse fusionnées avec des alphaRep. Ceci permettra de positionner ces enzymes à proximité les unes des autres, augmentant l’efficacité de voies de biosynthèse naturelles et permettant aussi de concevoir de nouvelles voies, et d’obtenir de nouveaux produits, par co-localisation d’enzymes provenant de voies différentes (biosynthèse combinatoire). Ces outils seront testés avec des voies de biosynthèse de PN peptidiques impliquant des cyclodipeptides synthases ou des synthétases de peptides non ribosomiques. Ils permettront d’étudier l’impact du "scaffolding" d’enzymes fournissant des précurseurs avec les enzymes les assemblant, dans le cas où il y a une forte compétition entre différentes voies pour ces précurseurs. L’effet du "scaffolding" sur l’efficacité d’une voie complexe sera aussi testé, dans une bactérie hôte hétérologue comme dans l’hôte d’origine. Enfin l’impact du "scaffolding" dans des approches de biosynthèse combinatoire sera évalué. Dans ce projet, de nouveaux outils de biologie de synthèse seront conçus, construits et testés chez différents microorganismes en prenant comme modèles des voies de biosynthèse de produits naturels dont certains ont des activités antibiotiques. Outre ces outils ce projet fournira des informations sur les éléments importants pour optimiser une voie de biosynthèse.