Etude de l'ADP-ribosylation d'ADN et de son rôle dans la réponse aux dommages à l'ADN – DNAPAR18

L'ADN cellulaire est constamment soumis à des stress exogènes et endogènes entraînant des dommages de base et des cassures de brin. Une mauvaise réparation des altérations nucléiques peut conduire à des conséquences délétères pour les cellules telles que les aberrations chromosomiques, l'instabilité génomique et la mort cellulaire. Les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs) utilisent le NAD+ pour catalyser la synthèse d'un polymère ramifié poly(ADP-ribose) (PAR) sur les protéines nucléaires. PARP1-3 sont considérés comme des senseurs de l’ADN endommagé, qui régulent les voies de réparation en recrutant des facteurs de remodelage de la chromatine et de réparation de l'ADN au niveau des sites altérés. Nos études in vitro récentes ont montré pour la première fois que PARP1 et PARP2 peuvent catalyser la ligation d'unités ADP-ribose sur des nucléotides présents au niveau des cassures de brins d'ADN. De plus, nous avons démontré que PARP3 peut produire des adduits de mono(ADP-ribose)-ADN sur des résidus phosphate terminaux aux extrémités DSB et SSB, révélant un mécanisme d’ADP-ribosylation de l’ADN par PARP3 ou PARP2. Nous avons constaté que, selon la configuration des ruptures de brins d'ADN, les extrémités de l'ADN peuvent devenir des sites accepteurs préférés pour l'ADP-ribosylation par rapport aux protéines. Nous avons démontré que l'ADN avec une brèche ADP-ribosylée pouvait être ligué pour donner un ADN continu contenant un site abasique aberrant. Nos résultats révèlent une activité efficace de PARylation de l'ADN dans des extraits cellulaires et fournissent une preuve indirecte de la présence d’adduits PARylés de l'ADN dans des échantillons d'ADN génomique purifiés après un traitement génotoxique. Ces résultats suggèrent que certains types de cassures d'ADN complexes peuvent être efficacement ADP-ribosylés par des PARPs dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN. Il est important de noter que ces processus sont réversibles puisque PAR peut être dégradé par la poly(ADP-ribose)glycohydrolase. Ces premières découvertes définissent une nouvelle fonction des PARPs. L'ADP-ribosylation des extrémités de brins d'ADN pourrait : bloquer de manière temporaire leur transformation et les protéger contre une dégradation non spécifique ou une jonction aberrante; activer un signal apoptotique; déclencher la relocalisation des loci d'ADN endommagés dans le noyau ou le recrutement et l'assemblage des facteurs spécifiques de la réparation. Un enjeu majeur aujourd’hui est de démontrer la présence d'ADP-ribosylation de l'ADN dans les cellules vivantes et de caractériser leur pertinence physiologique.
L'objectif principal du présent projet est de révéler le rôle de l'ADP-ribosylation de l'ADN dans la réponse aux dommages à l'ADN, et dans la coordination de la réparation des cassures de brins. Nous développerons à cette fin de nouveaux outils d’analyse sensibles et spécifiques. Nous proposons ici: (i) de caractériser la spécificité du substrat de l'ADN et les mécanismes d'ADN PARylation par PARPs; (ii) d’étudier le rôle de l'ADP-ribosylation de l'ADN dans la jonction d'extrémités non homologues; (iii) d'élaborer une analyse par spectrométrie de masse avancée des nucléotides ADP-ribosylés ; (iv) de produire des anticorps spécifiques des adduits d'ADN ADP-ribosylé; (v) d’identifier les adduits d'ADN ADP-ribosylé et leurs "lecteurs" ou "correcteurs" potentiels dans des cellules de mammifères exposées à divers traitements génotoxiques. La réalisation de ces diverses tâches nous permettra d’obtenir des outils performants de recherche des adduits ADP-ribosylés de l’ADN et de préciser les fonctions biologiques des modifications de l’ADN générées par PARP. Enfin, les nouvelles connaissances concernant les mécanismes d'action de PARP pourront être mises à profit afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou diagnostiques impliquées dans les maladies associées aux altérations de l'ADN, aux processus d’inflammation et de vieillissement.