Etude de l'ADP-ribosylation d'ADN et de son rôle dans la réponse aux dommages à l'ADN – DNAPAR18

La présente proposition repose à la fois sur des méthodes avancées conventionnelles et nouvelles dans le domaine de la biochimie de l'ADN / des protéines et de la biologie moléculaire. Parmi les méthodes avancées, on peut noter: l'approche MultiBac pour l’expression de complexes multiprotéiques; Adductomique d'ADN basée sur la spectrométrie de masse (MS) pour l'identification des adduits d'ADN ribosylés par l'ADP dans l'ADNg; protéomique pour l'identification des protéines interagissant avec les adduits ADP-ribose-ADN; test NHEJ ex vivo permettant un suivi détaillé de la réparation du plasmide rapporteur avec des DSB définis / ADP-ribosylés; approches de pointe, SPRi et switchSense pour les caractérisations biophysiques des interactions protéine-ADN.

Nous avons démontré que le phosphate 3'-terminal aux extrémités de cassure double brin d'ADN sert de site accepteur majeur pour la PARylation catalysée par PARP1 en fonction de l'orientation et de la distance entre les cassures de brin d'ADN dans une seule molécule d'ADN. Un modèle mécanistique de modification de l'ADN par PARP1 a été proposé. Un enrichissement significatif de certaines protéines sur l'ADN MARylé par rapport à l'ADN non MARylé dans les extraits de cellules humaines a été observé dans les analyses protéomiques. Des cibles protéiques potentielles responsables de la reconnaissance de l'ADN ADP-ribosylé ont été identifiées. Les premières preuves de la présence d'adduits PAR-ADN dans les cellules humaines après différents traitements génotoxiques ont été obtenues. Plusieurs facteurs c-NHEJ ont été purifiés jusqu'à homogénéité pour la mesure de leur interaction avec l'ADN ADP-ribosylé.

Perspectives d'avenir: Identification des adduits ADN-ADP-ribosylés et des protéines responsables de la détection et / ou de l'élimination des adduits ADP-ribosylés de l'ADN dans les cellules vivantes; Développement d'outils spécifiques pour l'identification des adduits ADN-ADP-ribose au sein de l’ADN génomique; Connaissance approfondie des fonctions des protéines PARP et du rôle de l'ADN-ribosylation dans la signalisation aux dommages à l'ADN et la réparation de l’ADN.

1. Taipakova S, Kuanbay A, Saint-Pierre C, Gasparutto D, Baiken Y, Groisman R, Ishchenko AA, Saparbaev M, Bissenbaev AK (2020). The Arabidopsis thaliana Poly(ADP-Ribose) Polymerases 1 and 2 Modify DNA by ADP-Ribosylating Terminal Phosphate Residues. Front Cell Dev Biol. 8, 606596. doi.org/10.3389/fcell.2020.606596.
2. Sutcu H.H., Matta E., Ishchenko A.A. (2020). Role of PARP-catalyzed ADP-ribosylation in the Crosstalk Between DNA Strand Breaks and Epigenetic Regulation. J Mol Biol. 432, 1769-1791. doi.org/10.1016/j.jmb.2019.12.019.
3. Matta E., Kiribayeva A., Khassenov B., Matkarimov B.T., Ishchenko A.A. (2020). Insight into DNA substrate specificity of PARP1-catalysed DNA poly(ADP-ribosyl)ation. Sci Rep. 10, 3699. doi.org/10.1038/s41598-020-60631-0.
4. Kladova O.A., Iakovlev D.A., Groisman R., Ishchenko A.A., Saparbaev M.K., Fedorova O.S., Kuznetsov N.A. (2020). An Assay for the Activity of Base Excision Repair Enzymes in Cellular Extracts Using Fluorescent DNA Probes. Biochemistry (Mosc). 85, 480-489. doi.org/10.1134/S0006297920040082.
5. Bazlekowa-Karaban M., Prorok P., Baconnais S., Taipakova S., Akishev Z., Zembrzuska D., Popov A.V., Endutkin A.V., Groisman R., Ishchenko A.A., Matkarimov B.T., Bissenbaev A., Le Cam E., Zharkov D.O., Tudek B., Saparbaev M. Mechanism of stimulation of DNA binding of the transcription factors by human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE1. // DNA Repair (Amst), 2019, 82, e102698. dx.doi.org/10.1016/j.dnarep.2019.102698.

L'ADN cellulaire est constamment soumis à des stress exogènes et endogènes entraînant des dommages de base et des cassures de brin. Une mauvaise réparation des altérations nucléiques peut conduire à des conséquences délétères pour les cellules telles que les aberrations chromosomiques, l'instabilité génomique et la mort cellulaire. Les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs) utilisent le NAD+ pour catalyser la synthèse d'un polymère ramifié poly(ADP-ribose) (PAR) sur les protéines nucléaires. PARP1-3 sont considérés comme des senseurs de l’ADN endommagé, qui régulent les voies de réparation en recrutant des facteurs de remodelage de la chromatine et de réparation de l'ADN au niveau des sites altérés. Nos études in vitro récentes ont montré pour la première fois que PARP1 et PARP2 peuvent catalyser la ligation d'unités ADP-ribose sur des nucléotides présents au niveau des cassures de brins d'ADN. De plus, nous avons démontré que PARP3 peut produire des adduits de mono(ADP-ribose)-ADN sur des résidus phosphate terminaux aux extrémités DSB et SSB, révélant un mécanisme d’ADP-ribosylation de l’ADN par PARP3 ou PARP2. Nous avons constaté que, selon la configuration des ruptures de brins d'ADN, les extrémités de l'ADN peuvent devenir des sites accepteurs préférés pour l'ADP-ribosylation par rapport aux protéines. Nous avons démontré que l'ADN avec une brèche ADP-ribosylée pouvait être ligué pour donner un ADN continu contenant un site abasique aberrant. Nos résultats révèlent une activité efficace de PARylation de l'ADN dans des extraits cellulaires et fournissent une preuve indirecte de la présence d’adduits PARylés de l'ADN dans des échantillons d'ADN génomique purifiés après un traitement génotoxique. Ces résultats suggèrent que certains types de cassures d'ADN complexes peuvent être efficacement ADP-ribosylés par des PARPs dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN. Il est important de noter que ces processus sont réversibles puisque PAR peut être dégradé par la poly(ADP-ribose)glycohydrolase. Ces premières découvertes définissent une nouvelle fonction des PARPs. L'ADP-ribosylation des extrémités de brins d'ADN pourrait : bloquer de manière temporaire leur transformation et les protéger contre une dégradation non spécifique ou une jonction aberrante; activer un signal apoptotique; déclencher la relocalisation des loci d'ADN endommagés dans le noyau ou le recrutement et l'assemblage des facteurs spécifiques de la réparation. Un enjeu majeur aujourd’hui est de démontrer la présence d'ADP-ribosylation de l'ADN dans les cellules vivantes et de caractériser leur pertinence physiologique.
L'objectif principal du présent projet est de révéler le rôle de l'ADP-ribosylation de l'ADN dans la réponse aux dommages à l'ADN, et dans la coordination de la réparation des cassures de brins. Nous développerons à cette fin de nouveaux outils d’analyse sensibles et spécifiques. Nous proposons ici: (i) de caractériser la spécificité du substrat de l'ADN et les mécanismes d'ADN PARylation par PARPs; (ii) d’étudier le rôle de l'ADP-ribosylation de l'ADN dans la jonction d'extrémités non homologues; (iii) d'élaborer une analyse par spectrométrie de masse avancée des nucléotides ADP-ribosylés ; (iv) de produire des anticorps spécifiques des adduits d'ADN ADP-ribosylé; (v) d’identifier les adduits d'ADN ADP-ribosylé et leurs "lecteurs" ou "correcteurs" potentiels dans des cellules de mammifères exposées à divers traitements génotoxiques. La réalisation de ces diverses tâches nous permettra d’obtenir des outils performants de recherche des adduits ADP-ribosylés de l’ADN et de préciser les fonctions biologiques des modifications de l’ADN générées par PARP. Enfin, les nouvelles connaissances concernant les mécanismes d'action de PARP pourront être mises à profit afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques ou diagnostiques impliquées dans les maladies associées aux altérations de l'ADN, aux processus d’inflammation et de vieillissement.