Les oligosaccharyldiphosphodolichol diphosphatases : enzymes orphelines éliminant des déchets toxiques ? – DLODESTRUCT

Les biologistes (partenaire 1) développeront des tests in vitro pour les activités du DLODP et, en utilisant une approche comparative de biochimie / phylogénétique, examineront le répertoire DLODP d'organismes simples tels que les bactéries, les protistes et les champignons, dont les génomes ont été séquencés et identifieront les matières de Identification DLODP. Les activités DLODP seront solubilisées et des fractions enrichies en DLODP seront générées en utilisant des techniques classiques de chromatographie sur colonne. Ces fractions contenant du DLODP seront ensuite soumises à des procédures de purification par affinité. Les chimistes (partenaire 2) concevront et synthétiseront de nouvelles sondes fluorescentes adaptées aux dosages DLODP à haut débit, ainsi que des sondes biotinylées avec lesquelles des matrices d'affinité pour la purification DLODP peuvent être préparées. Dans une approche alternative, des sondes de liaison X biotinylées seront conçues et synthétisées. La protéomique quantitative sera utilisée pour identifier les protéines qui se lient spécifiquement aux billes d'affinité. Les «hits» candidats sélectionnés seront vérifiés par des études de régulation à la baisse / surexpression médiées par shRNA dans des modèles cellulaires préalablement caractérisés.

Les activités DLODPL ont été mesurées dans des préparations de membranes cellulaires totales dérivées de plusieurs protistes, champignons, plantes, cellules d'insectes et de mammifères. Les membranes dérivées de cellules de S. pombe exponentielles et stationnaires possèdent une activité DLODPL élevée et sont évaluées comme matière de départ potentielle pour l'enrichissement en DLODPL. Alors que l'activité DLODPL a été détectée dans de nombreux protistes, champignons et cellules d'insectes, elle n'a pas été détectée dans les cellules végétales.
Les membranes de l'appareil de Golgi du foie de rat (GA), qui sont 20 à 30 fois enrichies pour le DLODPL et le marqueur GA UDP-galactose galactosyltransférase (UGT) par rapport à l'homogénat de foie, constituent le point de départ de la purification DLODPL. Apres solubilisation et fractionnement par chromatographie, les fractions enrichies en DLODPL sont subjugués au chromatographie d'affinité. Les résultats protéomiques des expériences préliminaires de chromatographie d'affinité (lipide II/vancomycine-Sepharose) montrent que les protéines transmembranaires et les protéines contenant des domaines de liaison aux nucléotides sont enrichies.
La synthèse de blocs de construction clés ((+) - ester de N-hydroxysuccinimide de biotine, phosphate de solanésyle, GlcNAc-1-phosphate 2,3,6-triacétylé portant à l'oxygène en C4 un azide d'éthyle (A) ou un amide d'éthyle remplaçant le La position 4 'd'une 4- (prop-2-yn-1-yloxy) -benzophénone (B)) a été obtenue. A partir de ces composés, des sondes pour matrices d'affinité améliorées ont été synthétisées comprenant une biotine-PEG8-GlcNAc-PP-Solanesol et de la biotine-PEG8-Solanesol à utiliser comme contrôle négatif. Le GlcNAc-PP-solanesol biotinylé ainsi que le composé témoin ont été testés dans le test DLODP et sont actuellement testés comme adsorbants de matrice de contrôle et d'affinité pour le DLODP. De manière complémentaire, la synthèse des sondes d'affinité à partir de B est en cours.

Le partenaire 1 a démontré que les activités du DLODP sont répandues dans les différents domaines de la vie. Des activités DLODP robustes ont été observées chez certains protistes, toutes les levures examinées, ainsi que des cellules d'insectes et des cellules de mammifères. Il est à noter que nous n'avons pas pu détecter l'activité DLODP dans les cellules végétales. Nos premiers résultats indiquent la présence d'une activité DLODPL dans l'apicomplexa, Theileria annulata (Ta). Ceci est surprenant car Ta n'est pas rapporté aux protéines N-glycosylées. En effet, l'annotation du génome Ta n'abrite pas de gène d'oligosaccharyltransférase. Cependant, nous avons recherché dans les données du génome Ta et Ta RNASeq d'autres enzymes nécessaires à la biosynthèse des DLO. Nous avons identifié un homologue ALG7 qui devrait coder pour un dolichylphosphate: UDP-GlcNAc GlcNAc-1P transférase qui pourrait générer un substrat DLODP (GlcNAc-PP-dolichol). En collaboration avec Gordon Langsley à l'Hôpital Cochin, nous étudions maintenant la possibilité intrigante que Ta nécessite un simple DLO pour des raisons autres que la N-glycosylation des protéines.
Le partenaire 2 a développé une méthode robuste et à haut rendement pour la préparation de dérivés de GlcNAc-1PP-solanésyle. Des rendements constants et reproductibles de 73% ont été obtenus dans les conditions développées pour la création de la liaison diphosphate alors que le rendement de cette réaction dans les conditions classiques décrites dans la littérature ne dépasse généralement pas 25%. Ce résultat très intéressant sera prochainement soumis à publication.
Des sondes d'affinité complexes ont été synthétisées.

Publications

1. Bosco M, Paik SJ, Busca P, Moore SEH, Gravier-Pelletier C. (2020) Synthetic route to glycosyl ß-1C-(phosphino)-phosphonates as unprecedented stable glycosyl diphosphate analogs and their preliminary biological evaluation. Molecules. 25(21): 4969. doi: 10.3390/molecules25214969.

2. Masserweh, A and Moore, S.E.H. (2021) Oligosaccharides, oligosaccharyl phosphates and glycosylation disorders. In Glycome: the hidden code in biology edited by Bannerjee, D. Nova Science Publishers Inc, Hauppauge, NY

Conference communications

1. Bosco, M. ; Paik, I S. –J ; Chantret, I. ; Moore, S. ; Busca, P. ; Gravier-Pelletier, C. Molecular tools to identify Dolichol Linked Oligosaccharides DiPhosphatases (DLODP) genes. IUPAC 2019, Paris, 7-12 july 2019 (Poster).

2. Bosco, M. ; Paik, S. –J. ; Chantret, I. ; Moore, S. ; Busca, P. ; Gravier-Pelletier, C. Molecular probe to isolate DLODP: an enzyme involved in type I Congenital Disorders Of Glycosylation (CDG-I). EFMC-ISMC 2020, XXVI EFMC International Symposium on Medicinal Chemistry, Bâle (Suisse), September 6-10, 2020 (Poster, reporté)

Contexte : La N-glycosylation des protéines repose sur le transfert d'un oligosaccharide du précurseur lié au dolichol (Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol, DLO) sur les protéines néo-synthétisées dans la lumière du réticulum endoplasmique. Ce processus est vital et des mutations dans les gènes impliqués dans la biosynthèse du DLO ou associés au transfert de cet oligosaccharide sur les protéines, sont responsables de pathologies rares appelées Congenital Disorders of Glycosylation de Type I (CDG-I). Bien qu'il soit connu que de telles mutations induisent une hypoglycosylation des glycoprotéines et une accumulation de formes non matures du DLO, tronqué dans sa partie oligosaccharidique, pour la plupart de ces maladies qui présentent des symptômes multi-systémiques et souvent sévères, le lien entre génotype et phénotype n'est pas connu. Il n'y a pas de traitement étiologique pour la majorité des CDG-I, en partie à cause de la méconnaissance des mécanismes de la régulation de la biosynthèse des DLO, dans les situations physiologiques, normales ou pathologiques. Les DLO diphosphatases (DLODPs), enzymes orphelines dont les gènes n'ont pas encore été identifiés, clivent les DLO tronqués observés dans certaines situations pathologiques telles que le CDG-I, mais leurs rôles dans les cellules normales ou pathologiques restent à déterminer.

Hypothèse : Nous émettons l'hypothèse que les DLODPs jouent un rôle vital en détruisant les intermédiaires tronqués du DLO qui pourraient avoir des effets toxiques au niveau cellulaire.

Objectifs : Identifier les gènes codant pour les DLODPs et tester cette hypothèse.

Méthodes : L'approche multidisciplinaire proposée a été conçue par des chercheurs qui collaborent depuis de nombreuses années à l'étude du rôle des protéines N-glycosylées dans des conditions saines ou pathologiques. Les biologistes développeront des dosages in vitro pour les activités DLODPs ; et, en utilisant une approche comparative de biochimie/phylogénie, étudieront la diversité des activités DLODPs dans des micro-organismes comme les bactéries, les protistes et les levures, dont les génomes ont été entièrement séquencés afin d'identifier le matériel biologique de départ le plus approprié pour la caractérisation des gènes. Les chimistes concevront et synthétiseront de nouvelles sondes fluorescentes adaptées pour faire des dosage DLODP de routine, et également des sondes biotinylées qui permettront la purification de DLODP sur des matrices d'affinité. Une approche protéomique quantitative sera utilisée pour identifier les protéines qui se lient de façon spécifique sur les billes d'affinité. L'utilisation de siRNA ou des expériences de sur-expression dans des modèles cellulaires qui ont été caractérisés préalablement, permettront de valider le rôle des meilleurs candidats isolés.

Résultats attendus : La génération de sondes fluorescentes et de réactifs d'affinité pour étudier in vitro les activités des DLODP. L'identification de nouveaux gènes impliqués dans le processus de N-glycosylation. La détermination du rôle des DLODP dans les situations normales ou pathologiques.

Bénéfices : Afin de comprendre tous les aspects du processus de N-glycosylation, de manière à pouvoir prédire une quelconque modulation en fonction de perturbations pharmacologiques ou génétiques, les origines moléculaires, les partenaires, et les caractéristiques biochimiques de tous ses acteurs doivent être caractérisés. Ainsi l'identification des protéines et des gènes DLDOP conduira d'une part à la maîtrise des aspects fondamentaux du cycle des DLO et de l'homéostasie du processus de N-glycosylation des protéines, et d'autre part au développement potentiel de stratégies pour le traitement du CDG-I.