Role et spécificités fonctionnelles des facteurs de virulence de type ExoY à activité Nucléotidyl Cyclase dépendante de l’actine dans les infections de bactéries à Gram-négatif – activExoY

Pour déchiffrer leurs relations structure-fonction, nous analyserons plusieurs membres représentatifs de cette sous-famille de toxines NC activées par l'actine. Nos principaux objectifs sont de caractériser in vitro et dans les cellules leurs spécificités fonctionnelles et leur impact sur la dynamique d'auto-assemblage de l'actine. Nous étudierons les bases structurales de leurs mécanismes d'activation et de leurs spécificités enzymatiques, chercherons à identifier des inhibiteurs de l'activité nucléotidyl cyclase. Nous chercherons à évaluer les phénotypes et la prévalence de l’activité des ExoY présents dans les souches bactériennes incluses dans la collection de référence de P. aeruginosa. Nous étudierons les effets d’ExoY de P. a. sur la phagocytose, l'inflammation, la production de mucus ou l'intégrité des jonctions cellulaires dans les cellules infectées par P. a. en vue de déterminer l'importance d'ExoY dans la modulation de l'immunité innée des voies aériennes de l'hôte. Nous analyserons enfin l'interaction entre les facteurs de virulence de type ExoY et d'autres facteurs bactériens de virulence qui affectent le cytosquelette d'actine.

CONFIDENTIEL en l'absence de publications sur les resultats!!
RESULTATS EN COURS : Nous avons commencé à cloner, purifier et analyser plusieurs membres représentatifs de cette sous-famille de toxines NC activées par l'actine pour déchiffrer leurs spécificités fonctionnelles et leur relation structure-fonction. Nos résultats en cours (non-publiés) montrent notamment que le module de type ExoY de Vibrio nigripulchritudo ne perturbe pas in vitro la dynamique du cytosquelette d'actine comme la toxine ExoY de P. a.. A partir de nos analyses biochimiques, nous avons développé une stratégie originale par ingénierie des protéines pour étudier par cristallographie aux rayons X à l’échelle atomique comment ces toxines sont activées par leur cofacteur spécifique, qui est l’actine.
En parallèle nous avons étudié de façon systématique si les souches bactériennes incluses dans la collection de référence de P. aeruginosa étaient capables ou non de sécréter une protéine ExoY active. Cette collection provient d'une grande variété de sources cliniques ou environnementales et représente la grande diversité de cette espèce. Elle comprend également des isolats provenant de patients atteints de mucoviscidose (CF). Les séquences polypeptidiques ExoY varient entre ces souches. Les études antérieures qui ont montré la forte conservation du gène ExoY parmi les souches de P. a. cliniques ou environnementales, se sont limitées à évaluer la présence du gène exoY, sans évaluer la sécrétion et l’activité des protéines ExoY.
Notre nouvelle analyse des souches incluses dans la collection de référence de P. a. révèle que la prévalence globale de l'activité ExoY est de 57,5 % pour les 40 souches examinées, sans différence significative entre les isolats CF (58 % des 24 souches) et les isolats non CF (56 % des 16 souches).

CONCLUSION : Le présent travail a montré que l'activité guanylate cyclase d'ExoY peut être mesurée directement dans les surnageants bactériens et nous a permis d'analyser les souches de la collection internationale P. aeruginosa pour leur capacité à sécréter la protéine ExoY active. Aucune différence significative n'a été observée entre les isolats des isolats CF et non CF. À l'aide de modèles d'infection cellulaire, nous avons démontré que les souches dépourvues d'ExoY sont cytotoxiques par rapport à leur homologue sauvage isogénique. Cela suggère qu'au moins dans certaines conditions, ExoY pourrait avoir une fonction protectrice de la cellule hôte.

A court terme, nous allons poursuivre nos travaux pour caractériser in vitro et dans les cellules plusieurs membres représentatifs de cette sous-famille de toxines NC activées par l'actine afin de déchiffrer leurs spécificités fonctionnelles, leurs impacts sur le cytosquelette d’actine, leurs localisations cellulaires et l’ensemble de leurs mécanismes cytotoxiques. Nos résultats préliminaires sur des protéines chimériques ingénierées devraient nous permettre d’avancer aussi cette année au niveau des analyses structurales du mécanisme d’activation de ces toxines NC par l’actine. Ces analyses seront importantes pour comprendre en détail leur relation structure-fonction. Nous poursuivrons aussi nos travaux visant à déterminer l'importance d'ExoY de P. aeruginosa dans la modulation de l'immunité innée des voies aériennes de l'hôte.
A plus long terme, nous chercherons à développer des stratégies de criblages haut débit pour identifier et étudier au niveau biochimique, structurale et cellulaires des petites molécules inhibitrices de ces toxines NC non-conventionnelles. Nous chercherons enfin à comprendre si et comment la cytotoxicité et/ou l’activité des toxines de type ExoY activées par l'actine sont affectées par d'autres toxines bactériennes qui manipulent le cytosquelette de l'actine et vice versa.

1 article (Hazel et al.) in preparation for WP-3 and WP-4 (submission in 2020)

De nombreux microorganismes pathogènes manipulent les voies de signalisation dépendantes de l’AMP cyclique dans les cellules eucaryotes pour favoriser leur survie et leur prolifération chez l’hôte. Les facteurs de virulence de type ExoY représentent une nouvelle sous-famille atypique de toxines à activité nucléotidylcyclase (NC). L'Exoenzyme Y (ExoY) a d'abord été identifié comme une toxine sécrétée par le système de sécrétion de type 3 (T3SS) de Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste impliqué dans des infections nosocomiales. P. aeruginosa (P. a.) est aussi responsable d’infections respiratoires chroniques sévères chez les patients atteints de mucoviscidose. ExoY est présent dans 90 à 98 % des isolats cliniques de P. a., ce qui suggère un rôle important dans la pathogénicité de ces isolats, mais ce rôle reste mal compris dans les infections par P. a. Des modules enzymatiques ou protéines effectrices apparentés à ExoY et mal caractérisés ont également été trouvés récemment dans plusieurs toxines produites par diverses bactéries à Gramnégatif représentant des pathogènes émergents dans le règne animal. Certains se sont révélés essentiels pour la virulence bactérienne.

Nous avons récemment montré que les toxines NC sont puissamment activées dans la cellule hôte par un cofacteur eucaryote original qui est l'actine. Pourtant, nos résultats préliminaires suggèrent que ces toxines diffèrent entre elles dans leur sélectivité de substrat, leur interaction avec l'actine et mécanismes d'activation, leur impact sur la dynamique du cytosquelette d'actine, et leur distribution intracellulaire. Elles pourraient donc perturber différemment la signalisation des cellules hôtes. Notre objectif est ici de caractériser, au niveau moléculaire et structural et dans des modèles d'infection cellulaires pertinents, les spécificités fonctionnelles, le rôle précis et les mécanismes de virulence de cette nouvelle classe de toxines NC activées par l'actine. Notre étude pourrait aider à mieux comprendre les infections bactériennes par P. a. et divers organismes pathogènes à Gram négatif.

Pour déchiffrer leurs relations structure-fonction, nous analyserons plusieurs membres représentatifs de cette sous-famille de toxines NC activées par l'actine. Nos principaux objectifs sont de caractériser in vitro et dans les cellules leurs spécificités fonctionnelles et leur impact sur la dynamique d'auto-assemblage de l'actine. Nous étudierons les bases structurales de leurs mécanismes d'activation et de leurs spécificités enzymatiques, chercherons à identifier des inhibiteurs de l'activité nucléotidyl cyclase. Nous chercherons à évaluer les phénotypes et la prévalence de l’activité des ExoY présents dans les souches bactériennes incluses dans la collection de référence de P. aeruginosa. Nous étudierons les effets d’ExoY de P. a. sur la phagocytose, l'inflammation, la production de mucus ou l'intégrité des jonctions cellulaires dans les cellules infectées par P. a. en vue de déterminer l'importance d'ExoY dans la modulation de l'immunité innée des voies aériennes de l'hôte. Nous analyserons enfin l'interaction entre les facteurs de virulence de type ExoY et d'autres facteurs bactériens de virulence qui affectent le cytosquelette d'actine.

Notre projet de recherche sera novateur à plusieurs niveaux. Il élargira les connaissances fondamentales sur les mécanismes de virulence des effecteurs secrétés par un système T3SS dans les infections par P. a. Il permettra d’identifier les spécificités fonctionnelles des toxines apparentées à ExoY récemment identifiées dans des protéobactéries représentant des pathogènes émergents pour l’homme ou les animaux, et finalement d’explorer leur potentiel en tant que cible médicamenteuse. Enfin, notre projet pourra aider à mieux comprendre la pathogénicité de P. a. dans des maladies comme la mucoviscidose pour laquelle il n’existe pas encore de thérapie efficace.