Transformation génétique programmée : Staphylococcus aureus comme nouvel organisme modèle – GenTranSa

Ce projet sera divisé en deux parties délimitées par les questions posées et les méthodologies employées. Ces deux parties génèreront des résultats complémentaires qui se 'nourriront' mutuellement.
Le but de la première partie du projet est de caractériser le rôle d'acteurs connus et conservés. Dans tous les organismes modèles étudiés, le développement de la compétence est régulé au niveau de la transcription. C'est pourquoi nous proposons de caractériser le profile transcriptionel de gènes précoces (sigH, comKs) et tardifs (Tas 1). Pourcela, nous utiliserons la gfp et la luciférase comme rapporteur transcriptionnel et le RNA-sequencing.
Ensuite, une partie importante du projet sera dédiée à la caractérisation des étapes et acteurs de la transformation naturelle (Task 2). Pour cela, nous caractériserons la localisation de'acteurs conservés (ComGA, ComFA, ComEC, DprA) par microscopie à epifluorsecence, TIRF ou microscopie à super-résolution. L localisation de ces protéines sera ensuite comparée, au niveau de la cellule unique dans des chambres de microfluidique, à la trajectoire de l'ADN transformant depuis la surface de la cellule jusqu'au cytoplasme.
Dans la seconde partie du projet, nous utiliserons deux méthodes à haut-débit (RNA-sequencing et Y2H) dans le but d'identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la compétence ou la transformation (Task 3). La plateforme de séquençage présente dans notre institut nous permettra de connaitre l'état transcriptionnel de la cellule dans différentes conditions. Au contraire, le choix des appâts utilisés en Y2H orientera l'investigation de la fonction des partenaires identifiés.
Ces différentes méthodologies, intégrant depuis l'expression des gènes jusqu'à l'interaction, la localisation et la fonction des protéines devrait nous permettre de caractériser ce mode de THG depuis le signal jusqu'à la réorganisation génomique.

Nous avons obtenus trois résultats principaux au cours des 18 premiers mois qui ont ouvert de nombreuses voies d'exploration pour cette deuxième partie du projet.

- Nous sommes tout d'abord capables de contrôler le développement de la compétence dans un contexte génétique sauvage ce qui implique que nous avons le setup expérimental idéal pour étudier les voies de régulation impliquées.

- Nous avons également démontré que le quorum sensing (QS) occupe une place importante dans la régulation du développement de la compétence chez S. aureus. Cette caractéristique serait ainsi commune à tous les principaux organismes modèles et confirmerait l'importance de la communication entre cellules pour synchroniser l'entrée d'une population bactérienne dans une adaptation environnementale.

- Enfin, nous avons des résultats préliminaires concernant l’identification de plusieurs stimuli (ou stress) qui pourraient être perçus par S. aureus et en réponse auxquels les bactéries pour développer la compétence. Nous avons également identifié des voies de régulation potentielles qui pourraient percevoir et transmettre ces signaux jusqu'aux principales protéines régulatrices de la compétence.
Une fois confirmés, ces stimuli pourraient nous aider à comprendre les conditions requises in vivo pour que S. aureus induise le transfert horizontal de gène via la compétence pour la transformation naturelle.

- Confirmer nos hypothèses concernant les stimuli (Task 1)
- Tester nos candidats pour les voies de transduction du signal (Task 1)
- Finir et analyser par microscopie les différentes fusions entre les protéines de transformation et des protéines fluorescentes (Task 2)
- Définir avec précision (RNA-seq) les régulons des principaux régulateurs (SigH, ComK1 et ComK2) (Task 3)

Aucun pour l'instant.
Au moins 3 différentes parties du projet pourraient faire rapidement l'objet de publications.

Le transfert horizontal de gènes (THG) contribue de façon importante à l’évolution des espèces bactériennes. L’acquisition de certains gènes permet l’adaptation des bactéries en autorisant par exemple l’utilisation de nouveaux substrats ou la survie dans des environnements autrement considérés comme toxiques. L’analyse des séquences et des fonctions portées par de nombreux génomes a également révélé qu’un nombre important de gènes augmentant la virulence de pathogènes humains majeurs ont été acquis par THG. De plus, de nombreuses « super-bactéries » multi-résistantes ont émergées au cours des dernières années via la nouvelle acquisition de gènes de résistance aux antibiotiques. Staphylococcus aureus est un exemple emblématique des ravages causés par ces organismes multi-résistants associés à de sérieuses épidémies en milieu hospitalier mais également au sein de communautés d’individus sains.
La transformation génétique bactérienne est l’un des trois mécanismes principaux permettant le THG, avec la conjugaison et la transduction. La transformation génétique est définie comme la capacité à capturer de l’ADN exogène, à le transporter à travers l’enveloppe et à l’intégrer dans le chromosome par recombinaison homologue. A l’inverse des deux autres mécanismes, la transformation génétique est entièrement contrôlée par la cellule receveuse et les protéines essentielles à ces fonctions sont encodées par le chromosome. L’induction de l’expression des gènes essentiels à la transformation est induite lorsque les bactéries basculent dans un état physiologique différencié appelé compétence naturelle. Le nombre d’espèces connues pour être naturellement transformables a doublé au cours des vingt dernières années et de nouvelles bactéries disposant de telles aptitudes sont souvent décrites, l’une des dernières en date étant S. aureus.
Ce projet visera à caractériser compétence et transformation chez un nouvel organisme modèle, la bactérie pathogène S. aureus. Nous chercherons plus particulièrement à atteindre 5 principaux objectifs: i) identifier les signaux environnementaux conduisant au développement de la compétence, ii) déchiffrer les cascades transcriptionnelles transmettant ce signal jusqu’à l’activation de la transformation naturelle, iii) caractériser les acteurs et étapes impliqués dans la fixation, l’import et la recombinaison d’ADN exogène lors de la transformation, iv) définir les singularités qui font de la compétence et la transformation des processus uniques chez S. aureus, v) évaluer quand, où et comment la transformation naturelle participe à la plasticité génétique de S. aureus.
Ce projet pluridisciplinaire (profilage transcriptionnel, microscopie, cribles génétiques) reposera à la fois sur des approches orientées par des hypothèses mais également des méthodes non biaisées, à haut débit. Nos hypothèses s’appuient à la fois sur des acteurs, présents chez d’autres bactéries naturellement transformables et conservés chez S. aureus, mais également sur de nombreux résultats préliminaires. L’analyse du profil transcriptionnel de gènes conservés important pour la régulation de la compétence ainsi que la localisation d’acteurs conservés essentiels à la transformation nous permettra d’établir des références temporelles et spatiales nécessaires pour l’étude de ces processus chez S. aureus. En parallèle, nous utiliserons les méthodes de « Transposon-sequencing » et « double-hybride dans la levure » pour identifier de nouveaux acteurs qui viendront améliorer notre compréhension des mécanismes cités ci-dessus.
Finalement, les connaissances accumulées devraient nous permettre de comprendre comment S. aureus est devenu un pathogène humain majeur. De plus, l’optimisation de la transformation naturelle chez S. aureus nous permettra de simplifier la manipulation génétique de ce pathogène humain alors que son inhibition nous autorisera à proposer des stratégies pour lutter contre le transfert de résistance aux antibiotiques.