PIGIMMUNITY: une approche de biologie des systèmes pour stimuler la réponse innée chez le porc – PIGIMMUNITY

Production de flagelline recombinante
La flagelline recombinante FliC?174-400 provient de S. enterica serovar Typhimurium FliC et a été produite avec une étiquette histidine.

Culture primaire de cellules épithéliales des voies respiratoires de porc (AEC)
Les cellules épithéliales ont été disséquées des bronches de porcs âgés de 1 mois par digestion enzymatique pendant 24h à 4°C. Les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence puis dans une interface air-liquide (ALI). La différenciation de l'épithélium a été évaluée par la mesure de la résistance électrique transépithéliale et la détermination de la présence de cils et de cellules à mucus à l'aide des anticorps Anti-ß -Tubuline-Cy3 et Anti-MUC5AC. Les jonctions serrées ont été colorées avec des anticorps monoclonaux purifiés de souris anti-humains ZO-1.
Développement d'une lignée de cellules épithéliales bronchiques porcines immortalisées
Des cellules épithéliales différenciées des voies respiratoires de porc ont été envoyées à InSCREENex GmbH pour développer une lignée cellulaire immortalisée. La différenciation de la lignée cellulaire en un épithélium des voies aériennes a été évaluée comme décrit ci-dessus.

Imagerie Ca2+ des AECs
L'imagerie du Ca2+ a été réalisée dans des cultures de cellules épithéliales des voies respiratoires (AEC) à l'interface air-liquide (ALI). Les cellules ont été chargées avec du fura-2/AM (5 µM ; Invitrogen) pendant 60 min.

Analyse de l'expression génétique
Pour surveiller la réponse inflammatoire TLR5, les cellules épithéliales des voies respiratoires (AEC) ont été stimulées du côté apical avec différentes concentrations de flagelline ou d'inhibiteurs, selon le plan expérimental. L'ARN a été extrait et l'expression des gènes évaluée par Biomark HD RT-qPCR ou RNA-seq.

Imagerie confocale
La translocation nucléaire de P65 a été imagée pour déterminer l'activation de la voie NFkB.

Tâche 1.1 : Détermination de la réponse des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires (AEC) à la flagelline
Nous avons examiné l'activation dose-dépendante de la signalisation TLR5. Nous avons observé une réponse NF-?B ultrasensible (coefficient de Hill >1) à la flagelline avec une EC50 de 13,68 ng/ml et un maximum à 100 ng/ml. Aucune activation n'a été observée pour la P38. L'activation maximale de P65 était corrélée à l'expression maximale des cytokines pro-inflammatoires. L'analyse RNA-seq a identifié un total de 106 gènes exprimés de manière différentielle (DEG). La plupart des DEG étaient des gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires et des gènes impliqués dans la voie NF-?B.
L'inhibition de la sarco-/ER Ca2+ ATPase avec la thapsigargin a conduit à une augmentation de l'expression des gènes par rapport aux AEC non prétraitées en réponse à la flagelline. Cependant, lorsque nous avons mesuré la dynamique du Ca2+ cytosolique dans les CEA chargées avec le colorant Ca2+ fura-2, nous avons constaté que la stimulation de la flagelline n'a pas conduit à un pic de Ca2+.
Tâche 1.2. Évaluation de l'effet de la pré-stimulation de la flagelline dans la réponse à un second stimulus inflammatoire
Le prétraitement des AECs avec une faible entrée de flagelline (1 ng/ml) n'a pas eu d'effet sur la réponse des AECs à un second stimulus de flagelline ou de LPS. Cependant, un prétraitement élevé de flagelline a significativement diminué la réponse des cellules à un second stimulus de flagelline (aucun effet sur le LPS). L'évaluation de la translocation nucléaire du NFkB a montré que cet effet est maintenu jusqu'à 1 semaine après le prétraitement à la flagelline.
Les cellules prétraitées par la flagelline ont présenté une augmentation de 7 fois de la libération de Ca2+ induite par l'histamine. Ces données suggèrent que la flagelline peut avoir un effet sur l'homéostasie du calcium, ce qui peut affecter l'intensité de la réponse immunitaire

Détermination du rôle de la signalisation NF-?B et Ca2+ pendant la période de pré-stimulation par la flagelline.
Chacune de ces voies de signalisation sera inhibée sélectivement pendant la pré-stimulation afin de déterminer si la réponse cellulaire à un second stimulus est restaurée à des valeurs similaires à celles des contrôles non pré-stimulés.
Détermination de l'effet de la flagelline sur la réponse des cellules épithéliales des voies respiratoires (AECs) à Actinobacillus pleuropneumoniae (App)
AECs seront prétraitées avec de la flagelline et infectées avec App. La réponse immunitaire sera évaluée par Biomark HD Fluidigm et par imagerie confocale. Ensuite, nous évaluerons le rôle de la flagelline dans les poumons de porc in vivo. Pour cela, des porcs âgés de 8 à 10 semaines seront inoculés avec de la flagelline et les changements dans l'expression génétique et la population de cellules immunitaires seront évalués.
Nous déterminerons ensuite l'effet protecteur in vivo de la flagelline contre l'App. Les porcs seront inoculés avec flagelline, puis infectés par l'App. L'évaluation clinique, les paramètres hématologiques et histologiques, la charge bactérienne et la survie des porcs seront évalués pour évaluer la pertinence de la stimulation immunitaire de la flagelline dans l'infection par l'App.

Modélisation mathématique de la signalisation TLR5
Les données recueillies dans les tâches 1 et 2 seront utilisées pour l'estimation des paramètres et le raffinement du modèle. Le modèle produira de nouvelles hypothèses et de nouvelles connaissances sur la signalisation de TLR5. Des analyses de sensibilité des paramètres seront utilisées pour identifier les paramètres sensibles/robustes ainsi que le comportement de signalisation. Cela permettra de mieux comprendre comment les niveaux et la durée des stimuli contrôlent la réponse immunitaire et d'identifier de nouvelles cibles moléculaires potentielles pour améliorer l'immunité.

Revues à comité de lecture
1. Airway administration of flagellin regulates the inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa. Raquel López-Gálvez, Isabelle Fleurot, Pablo Chamero, Sascha Trapp, Michel Olivier, Claire Chevaleyre, Céline Barc, Mickael Riou, Christelle Rossignol, Antoine Guillon, Mustapha Si-Tahar, Tobias May, Pascal Barbry, Andrea Bähr, Nikolai Klymiuk, Jean-Claude Sirard, Ignacio Caballero. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2021. ACCEPTED
2. TLR5 signalling is hyper-responsive in porcine cystic fibrosis airways epithelium. Isabelle Fleurot, Raquel López-Gálvez, Pascal Barbry, Antoine Guillon, Mustapha Si-Tahar, Andrea Bähr, Nikolai Klymiuk, Jean-Claude Sirard, Ignacio Caballero. Journal of Cystic Fibrosis. 2021 SUBMITTED

Autres
Développement d'une lignée de cellules épithéliales bronchiques porcines. Afin de développer certaines des expériences du projet, nous avons développé une lignée cellulaire épithéliale bronchique qui conserve les caractéristiques des cellules épithéliales bronchiques primaires. Cette lignée cellulaire sera disponible pour la communauté scientifique.

Dans la perspective d’une production alimentaire durable et sûre, l'industrie porcine est confrontée à un nombre de défis croissants. D'ici 2050, la population mondiale devrait atteindre plus de 9 milliards d'habitants et la demande en protéines animales devrait au moins doubler. L'intensification de l'élevage a permis d'accroître la production alimentaire, mais les fermes intensives sont devenues de plus en plus dépendantes des antibiotiques aussi bien pour la prévention que pour le traitement des maladies. Ces facteurs ont induit l'émergence de nouvelles bactéries résistantes aux antibiotiques et, par la suite, l'augmentation de l'échec thérapeutique. La tendance accrue de la résistance aux antibiotiques d'Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp.), causant la pleuropneumonie porcine en est un exemple. De nouvelles lois et de nouveaux programmes ont été mis en place pour réduire l'utilisation des antibiotiques et l'apparition de ces résistances aux antibiotiques. Cependant, il y a un risque d'augmentation de l’incidence de maladies entrainant des coûts économiques élevés.
La stimulation de l'immunité innée a été identifiée comme une stratégie prophylactique et/ou thérapeutique prometteuse pour combattre les maladies infectieuses en raison de sa capacité à activer les mécanismes immunitaires de l'hôte avec un large spectre de protection. À cet égard, la flagelline, un agoniste spécifique du système immunitaire inné, apparaît comme une stratégie alternative possible permettant d’augmenter la résistance aux maladies respiratoires et intestinales. Cette protection semble être liée à une activité pro-inflammatoire de la flagelline qui favorise le recrutement et la maturation des cellules immunitaires, préparant ainsi l'environnement muqueux à l’arrivée des bactéries. De plus, le prétraitement à la flagelline favorise la résolution complète du processus inflammatoire et semble réduire les lésions tissulaires. Comprendre ce processus permettra d'élaborer des stratégies meilleures et plus sûres qui combinent un niveau élevé de protection contre l'infection tout en évitant une inflammation exacerbée, ce qui conduira à une réduction de l'utilisation des antibiotiques.
PIGIMMUNITY propose une approche de biologie des systèmes en déterminant les facteurs qui contrôlent la modulation de l’immunité induite par la flagelline ainsi que ces qui accroissent la résistance aux maladies. Les études sur une seule cellule, la modélisation mathématique et l'évaluation in vivo de l'effet protecteur de la flagelline seront combinées afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents de la protection induite par la flagelline. Le projet générera des connaissances approfondies sur les mécanismes de régulation de l'immunité innée du porc, et plus particulièrement sur la signalisation TLR5. Il identifiera de nouvelles voies et des cibles moléculaires qui amélioreraient l'immunité des porcs et leur résistance aux maladies. Cette approche servira à mettre au point de meilleures thérapies (ou plus efficaces) et plus sûres combiné à un niveau élevé de protection contre les infections tout en évitant une inflammation exacerbée, améliorant ainsi les rendements de production et la compétitivité de l'industrie porcine. Cela permettrait de réduire l'utilisation des antibiotiques et, par conséquent, leurs résidus dans l'environnement, et contriburait à la réduction du développement de résistances aux antibiotiques.