Caractérisation de l’éducation du système immunitaire par SFB chez la souris et sa pertinence chez l’homme – MicroEducation

Tâche 1: Le rôle des cytokines IL36 sur l'activation immunitaire induite par le SFB
1. Croisement de souris IL36R-flox avec des lignées Cre (LCK et CX3CR1)
Les trois lignées de souris ont été obtenues et croisées. L'identification génétique s'est avérée difficile en raison de problèmes avec la PCR.
2. Caractérisation des réponses IL-36 chez les souris colonisées par SFB, OligoMM et souris conventionnelles (SFB +).
Les biopsies iléales de souris avec un microbiote différent ont été analysées pour l'expression des cytokines IL-36 et d'autres cytokines par rapport aux souris GF en utilisant qPCR.
3. Identification des cellules produisant de l'IL-36 dans les iléons de souris colonisées par le SFB
L'analyse cytométrique en flux a été utilisée pour trier huit populations de cellules différentes à partir de biopsies iléales et ont été caractérisées pour la production de cytokines IL36 par qPCR, en utilisant des souris conventionnelles et monoassociées SFB.
Tâche 2: Caractérisation du SFB humain
1- Séquence du génome du SFB humain
Après une configuration initiale et un dépannage à l'aide d'échantillons de contrôle, une bibliothèque Pacbio a été obtenue avec succès après la capture d'appâts ARN pour deux des échantillons fécaux dérivés du Mali. L'analyse des données en utilisant une combinaison de ce séquençage pacbio et illumina capturé et de l'ensemble de données de capture chromosomique a maintenant donné la séquence du génome SFB humain en 9 et 10 contigs.
2- Isolement du SFB humain en culture pure
Pour mettre en place le protocole de tri SFB FACS, nous nous sommes d'abord concentrés sur le SFB souris. Le SFB murin trié par FACS a été gavé chez des souris et suivi pendant 2 semaines. Bien que nous n'ayons pas eu de contamination, les souris n'ont pas non plus été colonisées par le SFB dans les deux expériences que nous avons effectuées. Cela peut être dû à des quantités insuffisantes de SFB ou à une perte de viabilité du SFB pendant le processus de tri.

Tâche 1: Le rôle des cytokines IL36 sur l'activation immunitaire induite par le SFB
Nous avons montré que le SFB, mais pas un cocktail de 12 autres souches bactériennes qui représentent les phylums majeurs du microbiote intestinal de souris, induit spécifiquement non seulement l'IL17A, mais aussi les cytokines IL36a? et IL36g dans l'iléon de souris axéniques . Ces résultats suggèrent que l'induction d'IL36??? fait partie de l'activation immunitaire médiée par le SFB provoquée par sa forte adhérence à l'épithélium iléal et que l'IL36??? est de nouveaux acteurs dans l'éducation immunitaire médiée par le SFB.
Nous avons par ailleurs montré que les cellules de la lignée myéloïde sont les principaux producteurs de ces cytokines dans l'iléon, et en particulier les cellules CD11b + CD11c- qui comprennent les macrophages et les monocytes, tandis que le récepteur IL36 est le plus fortement exprimé dans les cellules myéloïdes CD11c + MHCII + (cellules dendritiques et macrophages) et cellules T. Ces résultats soutiennent notre utilisation des souches de souris knock-out IL36R spécifiques CX3CR1 et Lck pour une analyse plus approfondie.
Tâche 2: Caractérisation du SFB humain
Nous avons réussi à établir des techniques pour coupler la capture d'appâts ARN avec la construction d'une bibliothèque d'insert longs pour des échantillons fécaux humains et de poulet complexes et avons obtenu deux séquences de génome SFB humain dans 9 à 10 contigs. Jusqu'à présent, notre analyse a montré que le génome du SFB humain est très similaire à celui du SFB d'autres hôtes, mais qu'il présente des différences génétiques intéressantes qui peuvent être liées à des adaptations spécifiques à l'hôte liées à l'absorption des nutriments et aux niveaux d'inflammation. Nos données montrent également que le SFB humain est plus proche du SFB de poulet et de dinde que celui du SFB de rongeur et qu'il a donc potentiellement été acquis de manière évolutive de manière horizontale plutôt que verticale.

Tâche 1: Le rôle des cytokines IL36 sur l'activation immunitaire induite par le SFB
3. Identification des cellules produisant de l'IL-36 dans les iléons de souris colonisées par le SFB
L'expression d'IL-36? était la plus élevée, c'est-à-dire les cellules myéloïdes CD11c-CD11b + et CD11c + MHCII +, les cellules T CD4 + et ensuite les cellules B B220. En revanche, une expression robuste d'IL-36R a été détectée dans toutes les catégories de cellules triées, bien qu'à des niveaux variables, avec la plus forte expression dans les cellules T CD4 + et les cellules myéloïdes CD11c + MHCII +. Un phénotypage supplémentaire est nécessaire pour affiner les types de cellules exprimant IL36. De plus, une analyse transcriptomique globale des échantillons iléaux WT et IL36a? KO sera réalisée sur des souris monocolonisées par SFB une fois que les animaux sans germes IL36a? KO seront à nouveau disponibles pour mieux comprendre la perturbation des voies de signalisation par la délétion IL36?.
Tâche 2: Caractérisation du SFB humain
1- Séquence du génome du SFB humain à partir d'échantillons fécaux complexes
Nous comparons maintenant les deux séquences génomiques l'une à l'autre et analysons la séquence génomique des gènes humains spécifiques du SFB. Mon analyse préliminaire suggère que l'intestin humain peut être plus élevé dans les espèces réactives de l'oxygène que l'intestin des souris, des rats et des dindes, et que le SFB humain présente des différences dans l'utilisation des nutriments.
2- Isolement du SFB humain en culture pure
Nous essayons maintenant d'obtenir des anticorps contre les antigènes SFB exposés en surface pour marquer mais aussi contre les SFB par immunocapture ou immuno-tri. L'analyse protéomique de surface SFB a identifié une protéine de surface majeure qui partage le domaine DUF4214 de l'antigène Th17 qui peut être impliqué dans l'ancrage de surface. Nous nous concentrons maintenant sur l'obtention d'anticorps contre cette protéine de surface.

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Caractérisation de l’éducation du système immunitaire par SFB chez la souris et sa pertinence chez l’homme

Le microbiote est un acteur intégral de la maturation post-natale du système immunitaire intestinal. Parmi les centaines d’espèces bactériennes formant le microbiote intestinal, nos études chez la souris et celles d’autres équipes ont montré que la bactérie segmentée filamenteuse (SFB) joue un rôle privilégié en induisant un état unique d’inflammation intestinale physiologique qui protège l’hôte contre divers pathogènes. Cette résistance accrue à la colonisation est due à la forte capacité de SFB à stimuler la maturation du tissu lymphoïde intestinal et à activer à la fois les réponses immunes innées et adaptatives. La caractéristique la plus remarquable de la colonisation par SFB est l’induction singulière d’une forte réponse intestinale Th17 quasi-absente lorsque le microbiote ne contient pas SFB. Par ailleurs, la colonisation par SFB induit également des réponses innées antimicrobiennes et de puissantes réponses IgA, elle diminue les seuils d’activation des cellules T et augmente la réactivité immunitaire des cellules dendritiques et T. Ainsi SFB module, et éduque d’une certaine façon, le système immunitaire afin de promouvoir la résistance aux pathogènes. Cet environnement immunitaire renforcé module également, et exacerbe majoritairement, la sévérité de la pathologie dans de nombreux modèles de maladies autoimmunes, faisant de la colonisation par SFB une arme à double tranchant pour l’hôte. Notamment, la présence de SFB étant prédictive d’une certaine composition des cellules immunitaires intestinales, d’une réactivité globale des cellules immunitaires, d’une résistance aux pathogènes et d’une susceptibilité aux maladies autoimmunes, la colonisation par SFB de l’intestin sert de biomarqueur pour le statut immunitaire de l’hôte.
SFB est présente chez de nombreuses espèces de vertébrés comme la souris, le rat, la truite, le poulet et le singe. La preuve de l’existence de SFB chez l’homme est largement basée sur l’analyse de la séquence de l’ADNr 16S, et reste encore débattue. Vu le rôle critique de SFB dans la régulation des réponses immunitaires dans des modèles animaux, il est primordial d’identifier et de caractériser SFB chez l’homme. A l’aide d’approches bio-informatiques, nous avons pu identifier des individus positifs pour SFB et vérifié la présence de SFB, et nous visons à caractériser exhaustivement la SFB humaine.
SFB se distingue des autres bactéries commensales par son adhésion intime à la barrière épithéliale intestinale, ce modèle pathogénique d’adhésion étant primordial pour le potentiel immunostimulant de SFB, en particulier les réponses Th17 et IgA . Les mécanismes moléculaires de la stimulation remarquable par SFB du système immunitaire de l’hôte restent cependant mal caractérisés. Les analyses menées dans le système in vitro de co-culture de SFB avec des cellules épithéliales que nous avons développé suggèrent le rôle possible d’une cytokine jusque-là peu étudiée. Nos données préliminaires montrent qu’elle est spécifiquement induite par SFB lors de la monocolonisation de souris axéniques. Notre objectif est maintenant de caractériser le rôle de cette cytokine dans les propriétés immunostimulantes de SFB en combinant l’étude de souris inactivées et son blocage in vivo chez des souris monocolonisées par SFB. 
L’objectif global de ce projet est donc d’établir de manière claire le bien-fondé de la recherche sur SFB chez l’homme en caractérisant la SFB humaine, et de définir les mécanismes à travers lesquels SFB influe de façon unique sur le dialogue entre hôte et son microbiote.. Ce travail a un potentiel thérapeutique prometteur via l’utilisation de SFB soit comme probiotique, soit comme vecteur vaccinal pour stimuler l’immunité et protéger l’homme contre des pathogènes, ou le développement de médicaments pour traiter les maladies autoimmunes et inflammatoires de l’intestin.