Analyse fonctionnelle des petits ARN nucléolaires orphelins chez les mammifères – SNORPHAN

Les petits ARN nucléolaires (snoARN) à motifs C/D et H/ACA représentent deux grandes familles d’ARN non-codants (ARNnc) impliquées respectivement dans la synthèse des 2’-O-methylations et des pseudouridines retrouvées dans les ARN ribosomiques (ARNr). Certains d’entre eux nommés scaARN s’accumulent également dans les corps de Cajal au sein desquels ils modifient les petits ARN du spliceosome (snARN). Le mode d’action de la grande majorité des ARN C/D et H/ACA est relativement bien connu: ils forment des appariements transitoires avec leurs ARN-cibles et positionnent le nucléotide à modifier dans le cœur catalytique de la méthyl-transférase ou de la pseudo-uridine synthase avec qui ils s’associent. Bien que la fonction précise des modifications chimiques guidées par les snoARN demeure largement incomprise, il est toutefois admis qu’elles modulent l’activité du ribosome et du spliceosome. L’importance biologique des snoARN est aussi fortement suggérée par des dérégulations de leur expression dans de nombreux cancers et certains contextes pathologiques tels que le syndrome de Prader-Willi. Fait remarquable, il existe aussi de nombreux ARN C/D et H/ACA qui n’apparaissent pas capables de modifier les ARNr ou les snARN et, de fait, leur fonction demeure peu documentée. Nous proposons un projet de recherche (SNORPHAN) consacré à l’étude de ces «snoARN orphelins». ORPHAN s’appuie sur de solides données non publiées démontrant que certains snoARN orphelins participent à des fonctions aussi diverses que la 2’-O-méthylation des ARN de transfert, la N4-acétylation de l’ARNr 18S ou la maturation du pré-ARNr 28S. D’autre part, nos analyses bio-informatiques indiquent que la plupart des snoARN orphelins modifient vraisemblablement des ARN cellulaires autres que les ARNr ou les snARN. Cette notion est compatible avec de récent travaux identifiant des méthylations en 2’-O-ribose et des pseudouridines au sein des ARNm et des longs ARNnc. En combinant des approches in silico, biochimiques, génomiques et génétiques, SNORPHAN vise à décrypter le mode d’action moléculaire des snoARN orphelins, et ce, aussi bien dans des cellules humaines cultivées in vitro que dans des tissus murins in vivo. Pour ce faire, nous comptons développer de nouvelles stratégies moléculaires non biaisées afin: (i) d’identifier le répertoire des ARN cellulaires ciblés par les snoARN orphelins et (ii) de cartographier les 2’-O-methylations et pseudouridines à l’échelle du transcriptome des cellules et des tissus. En utilisant le système CRISPR/Cas9, des lignées cellulaires KO pour les snoARN orphelins d’intérêt seront aussi générées afin de valider les ARN-cibles identifiés expérimentalement ou prédits in silico. Ces approches «perte-de-fonction» permettront aussi d’aborder l’influence des modifications de nucléotides sur l’expression des gènes et le comportent cellulaire. Dans un tel contexte, nous focaliserons particulièrement nos efforts sur SNORD115 et SNORD116, deux snoARN C/D exprimés principalement dans le cerveau et dont la perte d’expression corrèle avec une pathologie humaine rare: le syndrome de Prader-Willi. En résumé, notre projet permettra de décrire l’impact des snoARN orphelins sur la régulation de l’épi-transcriptome et, par là-même, de révéler de nouvelles fonctions inattendues orchestrées par les ARNnc de mammifères.