Etudes structurales et fonctionnelles de moteurs moléculaires membranaires homologues – MeMoX

Le but de ce projet est d’analyser la structure et le fonctionnement des complexes membranaires Tol et Ton qui permettent la transmission d’énergie à travers l'enveloppe des bactéries à Gram négatif. Ces complexes sont impliqués dans l'importation de nutriments, la division cellulaire et le maintien de l'intégrité de la membrane externe. Les complexes Tol et Ton de membrane interne se composent respectivement des sous-unités TolQ/TolR/TolA et ExbB/ExbD/TonB. Les moteurs TolQ/TolR et ExbB/ExbD transforment l'énergie issue de la force proton-motrice en énergie mécanique via les protéines associées TolA et TonB, respectivement. De par leur structure allongée, les domaines periplasmiques de TolA et TonB interagissent avec des protéines de membrane externe, le complexe TolB-Pal et les récepteurs TonB-dépendent, respectivement. Récemment, grâce à un financement de l'ANR (BacMolMot), nous avons résolu la structure du sous-complexe membranaire ExbB/ExbD. Ce complexe est formé d’un pentamère d’ExbB, très volumineux du coté cytoplasmique, délimitant un canal central dans lequel se positionne un monomère d’ExbD. Cependant la structure de l’oligomère ExbD présent dans le complexe n’est pas totalement résolue. Le but principal de ce projet est de déterminer si ces moteurs moléculaires partagent une structure similaire et s’ils fonctionnent différemment. Nous prévoyons l’analyse de la complémentation fonctionnelle d’E. coli par des moteurs TolQ/TolR ou ExbB/ExbD hétérologues. Afin d’analyser le fonctionnement de ces moteurs, nous étudierons plus spécifiquement l’implication du moteur TolQ/TolR dans le rôle joué par le complexe Tol-Pal dans la division cellulaire chez E. coli.
Notre projet se subdivisera en quatre axes couvrant une approche multidisciplinaire impliquant des approches génétiques, biochimiques, biophysiques et d'épifluorescence: 1) Basé sur notre expertise dans la purification des protéines membranaires, nous prévoyons de surproduire et purifier des complexes ExbB/ExbD et TolQ/TolR provenant de différent genre bactérien. Cette tâche sera réalisée par l'équipe de Roland Lloubes. 2) La détermination de la structure 3D de ces complexes sera effectuée en poursuivant la collaboration avec l’équipe de Susan Buchanan (NIH, Bethesda). 3) Parallèlement à cette approche structurale, nous étudierons le rôle du système Tol-Pal lors de la division cellulaire par microscopie de fluorescence in situ en collaboration avec l'équipe de Tâm Mignot. Nous avons construit des souches produisant chacune des protéines du complexe Tol-Pal fusionnées soit à la protéine fluorescente GFP soit à la mCherry qui sont totalement fonctionnelles. Toutes ces constructions ont été faite sur le chromosome. Nous envisageons de déterminer la localisation cellulaire de chaque protéine fluorescente hybride dans des souches mutées/délétées des gènes codant pour les protéines du système Tol-Pal. Ces expériences fourniront des informations précieuses sur le recrutement séquentiel des protéines Tol-Pal au niveau du septum, leur importance respective et permettront d'élucider le rôle du moteur TolQ/TolR dans l'assemblage du complexe Tol-Pal. Nous envisageons également de développer une approche de microscopie à haute résolution (HR) en microfluidique afin de pouvoir étudier la dynamique des protéines Tol-Pal en réponse à diverses conditions de croissance. 4) Enfin, l'interchangeabilité des deux moteurs moléculaires TolQ/TolR et ExbB/ExbD sera vérifiée par une analyse phénotypique des fonctions Tol et Ton et une analyse par microscopie HR. Cette tâche sera réalisée en collaboration avec l'équipe de TM.
L’équipe RL impliquée dans chacune de ces taches, coordonnera une nouvelle collaboration avec l’équipe TM pour élucider le rôle du moteur TolQ/TolR dans assemblage du complexe Tol/Pal au niveau de septum et consolidera une collaboration internationale avec l’équipe SB (avec qui nous avons résolu la structure 3D du complexe ExbB/ExbD d’E. coli).