Ingénierie des acides sialiques: une nouvelle stratégie pour la découverte alternative d’antibactériens. – NEURAPROBE

Objectif 1: Concevoir et synthétiser des rapporteurs chimiques de ManNAc et Neu5Ac. Concevoir et synthétiser de nouveaux des rapporteurs chimiques des acide légionaminique, pseudaminique et 8-épi-légionaminique.
Objectif 2: Développement de nouveaux outils pour l'imagerie cellulaire métabolique Concevoir et synthétiser des sondes métalliques pour l'analyse en fluorescence X comme alternative à la microscopie fluorescente.
Objectif 3: Développer un test HTS pour identifier d’inhibiteurs qui pourraient fournir de nouvelles pistes pour la conception de médicaments antibactériens / antivirulents.

La synthèse de dérivés alcynes et azotures de Neu5Ac et de ManNAc a été réalisée. L’incorporation métabolique de ces rapporteurs en cellule humaines (HeLA) a été validée. Les méthodes de ligation bioorthogonale (CuAAC et SPAAC) ont été retenues. Les rapporteurs ont été détectés par microscopie confocale de fluorescence après réaction avec des sondes fluorescentes.
La synthèse du dérivé de la ManNAc comportant un azoture à la place de la fonction alcool primaire en position 6 a été réalisée. Ce rapporteur devrait ne pas s’incorporer dans les cellules de mammifères contrairement aux bactéries. Cette hypothèse a été validée en cellules HeLa. Les expériences sont en cours sur des cultures de bactéries E. coli K1.
Les synthèses des sondes à base d’iridium ont été réalisées. Ces molécules peuvent être visualisées en fluorescence optique mais aussi par nanosonde X synchrotron afin d’obtenir des informations intracellulaires quantitatives et à la nanoéchelle. La réaction de ligation bioorthogonale avec des rapporteurs chimiques de la ManNAc a été vérifiée en solution par spectrométrie de masse et des essais en cellules humaines sont en cours. Deux versions comportant un bras espaceur PEG ont été conceptualisées et synthétisées. Les versions sans PEG font état d’un important marquage aspécifiques sur cellules HeLa. Des études de cinétique de réaction sont en cours par HPLC.
L’optimisation de la voie de synthèse bio-inspirée de dérivés Kdo a permis d’améliorer le rendement et le temps de cette voie de synthèse pour le dérivé Kdo-N3. Cette optimisation a aussi permis la synthèse d’un nouveau dérivé de Kdo, le KdoSSKdo. L’incorporation métabolique de cet analogue en cellule bactérienne (E. coli MG1655) a été validée. L’obtention de ce nouvel analogue permettra des expériences de double marquage avec des méthodes de ligation bioorthogonale différentes. La synthèse d’analogues alcène et alcyne du Leg est en cours. La synthèse d’analogues de Pse et 8eLeg est aussi en cours.

Les perspectives du projet sont d'obtenir des informations quantitatives 2D / 3D au niveau des organites sur une voie de glycosylation ciblée en utilisant la stratégie du rapporteur chimique bioorthogonal à base des sondes métalliques, démontrant l'importance de la fluorescence X pour une meilleure compréhension à un niveau moléculaire de la synthèse des oligosaccharides. Nous avons obtenu 15 shifts à l’ESRF - ID16A-NI (C07).

«Metabolic labeling of bacterial glycans” Guianvarc’h, D ; Boudreux, Y ;Biot, C. ; Vauzeilles, B. Glycoscience 2nd edition, in press.

Les acides sialiques (SA) sont les acteurs majeurs de nombreuses fonctions biologiques telles que la reconnaissance hôte-pathogène. Si les voies de biosynthèse des SA sont bien décrites chez les eucaryotes, cela n’est pas le cas chez les bactéries.
Les objectifs du projet NEURAPROBE sont de développer de nouveaux outils de marquage, d'étudier l'incorporation des SA via la stratégie du rapporteur chimique, dans les bactéries pathogènes par rapport aux cellules humaines, et dans des modèles d'infection cellulaire, pour déceler des différences fondamentales et identifier des cibles bactériennes qui serviront à cribler des banques chimiques.
Alors que la majorité des articles publiés se concentre sur une visualisation au niveau cellulaire via une sonde fluorescente, nous tenterons de gagner en résolution en utilisant des sondes métalliques détectables par des méthodes modernes de microscopie électronique. Cette ingénierie n’a encore jamais été utilisée sur de tels systèmes biologiques.