Phospholes biaryliques luminescents pour l’étude d’interactions peptides-récepteurs – LAPPRET

La synthèse de P-hydroxyphospholes oxyde ou sulfure et de P-aminophospholes portés par un squelette bisarylique a été mise au point, ainsi que leur couplage par l'atome de phosphore avec des acides aminés ou des peptides, dans les conditions de synthèse peptidique. Cette nouvelle méthode de couplage des phospholes aux biomolécules, a été appliquée au marquage du JMV2959 qui est un puissant antagoniste du récepteur sécrétagogue de l'hormone de croissance de type 1a (GHS-R1a). L’affinité des ligands marqués par un phosphole fluorescent pour le récepteur GHS-R1a a été étudiée par Transfert d'Energie par Résonance de type Förster (FRET). Enfin, les tests de compétition mis en oeuvre, ont démontré leur très grand intérêt pour la caractérisation d’autres ligands du récepteur GHS-R1a

Deux nouvelles classes de fluorophores, les P-hydroxyphospholes oxyde ou sulfure et les P-aminophospholes ont été mis au point, ainsi que leur couplage aux acides aminés et peptides, par l'atome de phosphore. Les bisarylphospholes et leurs produits de couplage, ont été caractérisés par spectroscopie d'absorption UV-visible et de fluorescence, et ils présentent des émissions de fluorescence avec un grand déplacement Stokes (= 70nm). Les P-hydroxyphospholes oxyde ont été utilisés pour le marquage du JMV2959, qui est un puissant antagoniste du récepteur sécrétagogue de l'hormone de croissance de type 1a, et les conjugués obtenus ont permis de caractériser d’autres ligands de ce récepteur.

La synthèse de P-hydroxyphospholes et de P-aminophospholes ayant des systèmes conjugués plus étendus tels que des phosphindoles dissymétriques et des dérivés porteurs de groupements électro-donneurs et accepteurs, est envisagée afin d’obtenir des émissions vers le rouge/proche infrarouge. La stratégie de greffage de ces phospholes sera appliquée prochainement au marquage de peptides d’intérêt tels que la neurotensine, la Ghréline [1-8]-Cys9 et du récepteur GHS-R1a, étudiés à l’IBMM. En lien avec les travaux du laboratoire portant sur le radiomarquage d’analogues conjugués de la neurotensine pour l’imagerie par tomographie par émission de positons (TEP) de cellules cancéreuses surexprimant le récepteur NTS1, la synthèse de phospholes boronatés est également envisagée, pour étudier le marquage bimodal de ce peptide par fluorescence et par TEP en utilisant le radioélément [18F].

Les travaux portant sur la synthèse des dérivés P-hydroxyphospholes oxyde ou sulfure et leur couplage aux groupements amine des acides aminés ou des peptides par formation de liaison P-N, ont fait l’objet de l’article «Fluorescent P-Hydroxyphosphole for Peptide Labeling through P-N Bond Formation », E Rémond, Jean-Alain Fehrentz, Laure Liénart, Sébastien Clément, Jean-Louis Banères, Florine Cavelier, Chem. Eur. J., 2022, 28, e202201526.

Les techniques de fluorescence sont sans cesse améliorées par la découverte de nouveaux fluorophores et la mise au point d’instruments de plus en plus performants. Ces dernières années, de nombreux travaux ont portés sur le développement de dispositifs pour l’optoélectronique, pour l'imagerie optique, le diagnostic et pour l’assistance en chirurgie par fluorescence dans le proche infrarouge (680-1300 nm), afin de minimiser l’interférence des tissus étudiés.
Un très grand nombre de fluorophores sont disponibles et sont utilisés selon leurs propriétés physico-chimiques et optiques (longueur d’onde d’absorption/émission, photostabilité, poids moléculaire, solubilité, sensibilité aux solvants et au pH, facilité de greffage…).
Le développement de fluorophores simples, stables et modulables pour permettre leur émission vers le rouge avec des déplacements de Stokes importants, est toujours d'un grand intérêt pour visualiser les mécanismes du vivant, en minimisant les phénomènes d'absorption ou d'émission, et pour améliorer la sensibilité et le contraste des images.
Parmi les fluorophores, les phospholes ont été largement utilisés pour le développement de diodes électroluminescentes organiques (OLED). Le phosphole est un hétérocycle diénique à cinq chainons ponté par un atome de phosphore tétraédrique, dont les modifications chimiques permettent d’en modifier la fluorescence.
La fluorescence des phospholes présente un déplacement de Stokes important qui s’explique par un transfert de charge de l’état excité vers une orbitale hybride LUMO. Cette caractéristique unique est propice pour conserver des déplacements de Stokes importants même dans le cas d’émission vers le rouge. Malgré ces propriétés optiques remarquables et leur stabilité photochimique, les phospholes n'ont quasiment pas été utilisés pour le marquage par fluorescence des biomolécules, comme les acides aminés ou les peptides.
Nous avons récemment décrit la synthèse stéréosélective de phosphole aminoacides complexés au borane et leur transformation en P(III), en dérivés oxyde, sulfure, ou sels de phospholinium ainsi qu’en complexe d’or (JACS 2018). De plus, les phospholes borane dérivés d’aminoacides peuvent être utilisés pour le C- et N- couplage peptidique en solution, et en synthèse peptidique supportée.
Cependant, comme le greffage de phospholes à une biomolécules implique jusqu’à présent l'utilisation d'anions phospholides obtenus par réaction avec du lithium, ces conditions sont assez peu compatibles pour développer des dérivés fonctionnalisés par des substituants électro-donneurs ou attracteurs, et pour obtenir des émissions jusqu’au proche infrarouge (NIR).
Par conséquent, le projet LAPRET a pour objectif d’étudier les propriétés luminescentes remarquables des phospholes pour un marquage innovant d’acides aminés et de peptides:
• En développant la synthèse de phospholes aromatiques et fonctionnalisés porteurs d’un groupement réactif sur le centre phosphoré (NR2 ou OH), afin de permettre leur couplage chimiosélectif avec des groupements hydroxyle, amino ou thiol de peptides, dans des conditions douces et neutres. Le borane sera utilisé comme groupement protecteur des groupements phospholes, pour isoler des complexes stables, facilement manipulables et transformables.
• En développant la synthèse de phospholes fonctionnalisés pouvant émettre jusqu’au proche infrarouge et avec des déplacements de Stokes importants. Les études photophysiques et les calculs TD-DFT permettront de comprendre et de prévoir les relations entre leur structure, les orbitales moléculaires et leurs propriétés spectrales.
• En appliquant les phospholes fonctionnalisés pour le marquage de fragments modifiés de neurotensine NT[8-13] et pour l’imagerie de reconnaissance de récepteurs NTs au sein de tissus vivants.