Nanogels ADN-protéine comme réacteurs enzymatiques – ActiveGEL

Le projet est divisé en 4 workpackages (WP). WP1 consiste en l'investigation systématique des morphologies de gels ADN-streptavidine obtenus dans différentes conditions avec de l'ADN de longueurs et de densités de biotinylation variables. Premièrement, la préparation d'ADN multibiotinylé, le composant principal de ces nanogels, sera améliorée. Ensuite, l'ADN résultant sera mélangé avec de la streptavidine et les structures obtenues caractérisées par AFM et DLS. Après l'optimisation des conditions de préparation des nanogels ADN-protéines, ils seront fonctionnalisés avec des enzymes individuelles ou un mélange de différentes enzymes pour donner des nanoréacteurs mono- et multi-enzymatiques (WP2 et WP3). L'effet de l'ADN sur les propriétés des enzymes (leurs activité et stabilité) sera ainsi étudié. Ensuite, dans le WP4 nous étudierons la transfection de nanogels ADN-protéines dans les cellules vivantes. L'interaction de la partie ADN des nanogels ADN-protéines avec les agents de transfection sera d'abord analysée par zétamétrie, DLS, AFM, microscopie de fluorescence et cytométrie en flux. Lorsque les conditions appropriées seront identifiées, nous étudierons le mécanisme de délivrance efficace de ces nanogels dans des cellules vivantes (observations par microscopie confocale ). En cas de succès, cette recherche constituera une nouvelle approche pour la transfection d'un grand nombre de fonctions à travers la membrane cellulaire.

Dans le WP1, afin d'obtenir l'ADN ayant un niveau de biotinylation élevé, nous avons utilisé l'amplification par PCR en présence de nucléotides biotinylés. En mélangeant l'ADN résultant avec de la streptavidine, des gels ADN-streptavidine de taille nanométrique ont été obtenus. La densité et la taille de ces nanogels a pu être contrôlées non seulement en ajustant la quantité de streptavidine réticulante, mais également en utilisant différents taux de biotinylation de l'ADN. En conséquence, des nanogels d'une taille allant de 80 à 200 nm ont été formés. WP2 et WP3 consistent en la fonctionnalisation des nanogels avec des enzymes individuelles et un mélange de différentes enzymes respectivement. Tout d'abord, la streptavidine conjuguée à la phosphatase alcaline (sAP), la peroxydase de raifort (sHRP) et à ß-galactosidase (ßGal) ont été mélangées avec de l'ADN biotinylé ce qui a donné des nanogels d'approximativement 150 nm de diamètre. Les activités et les stabilités des enzymes individuelles dans les nanogels ont ensuite été étudiées. Toutes les enzymes testées se sont avérées fonctionnelles. Les activités de l'AP et du ßGal étaient inchangées, tandis que celle du HRP était légèrement améliorée par les nanogels. Enfin, les 3 enzymes ont été chargées simultanément dans les nanogels d'ADN sans perte des activités catalytiques individuelles, démontrant ainsi une préparation réussie de nanoréacteurs multienzymatiques. WP4 vise la transfection de nanogels ADN-protéines dans des cellules vivantes. L'idée principale ici était d'utiliser des agents de transfection d'ADN pour transfecter l'ADN non pas comme support d'information, mais comme un vecteur des protéines actives. En combinant les techniques de microscopie à fluorescence et de cytométrie en flux, nous avons déjà étudié les conditions d'interaction de nos nanogels avec les lipides de transfection, et actuellement nous commençons à étudier la transfection de ces nanogels dans les cellules.

La perspective principale de ce projet de recherche consiste dans le développement d'une nouvelle approche pour la transfection des objets multifonctionnels nanométriques dans les cellules vivantes avec un intérêt potentiel pour la recherche fondamentale biotechnologique et biomédicale.

Ce projet de recherche à donné lieu aux 2 présentations à des séminaires internes au Japon (à Tokyo Institute of Technology et à l'Université Doshisha) et une présentation oral à distance au congrès IUPAC Macro2020+. Finalement, 1 article est publié dans Angewandte Chemie et 1 autre est actuellement soumis.

Ce projet concerne la conception et le développement d’un nouveau type de nanogels hybrides ADN-enzyme dont la taille ainsi que le taux de réticulation peuvent être contrôlés. La streptavidine sera utilisée pour induire la réticulation intramoléculaire des longs ADNs décorés avec de la biotine. L’utilisation de streptavidine conjuguée à une enzyme permettra alors d’incorporer cette enzyme dans des points de réticulation du nanogel. Après une étude des activités catalytiques et des stabilités thermiques et chimiques de différentes enzymes au sein du nanogel, ces derniers seront utilisés comme plateformes d’incorporation d’un mélange d'enzymes afin d’effectuer soit une cascade de réactions enzymatiques au sein du nanogel, soit d’obtenir des nano-réacteurs multifonctionnels. Par la suite, l'incorporation de nanoparticules magnétiques dans ces nano-réacteurs facilitera leur manipulation et leur purification, et l'incorporation de quantum dots permettra leur observation ainsi que leur détection. En dernier lieu, les propriétés poly-électrolyte de l’ADN seront utilisées pour mettre sous contrôle externe l’activité des enzymes incorporées, ainsi que pour effectuer leur transfection dans des cellules vivantes, ce qui pourrait avoir des implications en pharmacologie et en biotechnologies.