Contrôle spatial et temporel d’auto-assemblages induit par des enzymes localisées au sein d’hydrogels hôtes – EASA

Nous avons d'abord développé un gel hôte à base d'hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) servant de gel hôte. Nous avons synthétisé des peptides précurseurs de l'auto-assemblage et caractériser leur auto-assemblage d'abord hors du gel hôte et ensuite en présence du gel hôte. Nous avons utilisé des techniques de spectroscopie (fluorescence et IR). Nous avons également observé l'auto-assemblage dans le gel et commencé à en caractériser les propriétés rhéologiques. La répartition de l'auto-assemblage au sein du gel hôte se fait par microscopie confocale. Pour le développement des gels hôtes à gradient de concentration enzymatique nous développons des imprimantes 3D spécifiques permettant l'impression de plusieurs composés simultanément tout en faisant varier leurs concentrations.

Les études par microscopie confocale ont montré que l'auto-assemblage ne se fait pas uniformément dans le gel même si au départ les enzymes s'y répartissent uniformément. On observe un phénomène de «réaction-diffusion« conduisant à la formation d'un gradient de peptides auto-assemblés dans la direction perpendiculaire à la surface de l'interface gel/solution de peptide. Cela n'avait pas été prévu initialement et étudions actuellement ce phénomène. Il provient du fait que les enzymes peuvent diffuser dans le gel hôte. Nous travaillons actuellement sur le greffage des enzymes au gel hôte pour en limiter la diffusion. Nous avons également greffé les enzymes sur des nanoparticules et étudié l'auto-assemblage de peptides autour de ces nanoparticules comme prévu dans le projet. Nous avons observé qu'il s'opère une séparation de phase dans le gel due aux interactions entre nanoparticules. Enfin nous avons effectué des premiers tests de viabilité cellulaire sur les gels hybrides hôte/peptides auto-assemblés. Les cellules utilisées étaient des fibroblastes. Le gel hôte est non-adhérent pour cellules comme cela était prévu et les cellules présentent une adhésion en présence de l'auto-assemblage. Enfin nous avons mis au point une imprimante 3D en collaboration avec un fabriquant d'imprimante 3D permettant de préparer des gels hôtes à gradients de concentration en enzymes. Nous devrions réceptionner cette imprimante très prochainement.

Nous allons poursuivre l'étude de l'auto-assemblage dans un gel hôte en nous focalisant sur des gels dans lesquels les enzymes sont greffées afin de ne plus pouvoir diffuser. Nous allons également étudier l'auto-assemblage autour de nanoparticules fonctionnalisées avec des peptides et insérées dans les gels avant d'étudier l'auto-assemblage en présence de deux types de nanoparticules portant deux enzymes dont l'action conjointe est nécessaire pour induire l'auto-assemblage. En parallèle nous continuerons à développer les gels hôtes dégradables à base d'acide hyaluronique et y étudierons l'auto-assemblage. Nous continuerons à développer l'impression 3D conduisant à la formation de gradients de concentrations en enzymes. Nous poursuivrons les études cellulaires sur et dans ces gels avec des fibroblastes et avec des cellules souches.

1. M. Criado-Gonzales et al. Chem. Comm. DOI: 10.1039/c8cc09437c
2. M. Criado-Gonzales et al. Langmuir DOI: 10.1021/acs.langmuir.9b01420
3. J. Rodon Fores et al. Chem. Sci. DOI: 10.1039/c9sc00312f
4. J. Rodon Fores et al. Angew. Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.201909424
5. M. Criado-Gonzales et al. J. Mater. Chem. B DOI: 10.1039/d0tb00456a
6. M. Criado-Gonzales et al. Chem. Mater. doi.org/10.1021/acs.chemmater.9b04823
7. J. Rodon Fores Angex. Chem. Int. Ed. Angew. Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.201909424

Des matériaux supramoléculaires peuvent être considérés comme des systèmes chimiques vivants, étant basés sur des interactions dynamiques, non covalentes permettant ainsi de répondre à des stimuli extérieurs. Cependant la faiblesse de ces interactions conduit à de faibles propriétés mécaniques. Cette difficulté peut être contournée en incorporant un réseau supramoléculaire dans un gel "permanent" (agarose par exemple). Le caractère non permanent d'assemblages supramoléculaires a été exploité judicieusement par la nature pour permettre aux cellules de répondre à leur environnement. Ainsi, les filaments d'actine jouent un rôle essentiel dans la motilité des cellules. La nature contrôle les assemblages supramoléculaires spatialement et temporellement en initiant l'auto-assemblage par voie enzymatique, les enzymes transformant localement des protéines d'un état dans lequel elles ne s'assemblent pas (état NAA) dans un état où elles s'auto-assemblent (état AA). Le contrôle spatial de ces auto-assemblages se fait en localisant précisément les enzymes aux interfaces biologiques et à travers des gradients de concentrations d'enzymes. Le contrôle temporel est assuré par une production d'enzyme en temps voulu. De tels processus peuvent être mimés par l'auto-assemblage induit enzymatiquement (AAIE). Dans l'AAIE des enzymes sont utilisées pour transformer des molécules d'un état NAA dans un état AA initiant ainsi la formation d'un réseau supramoléculaire. Notre objectif est de développer une nouvelle génération d'hydrogels dynamiques et spatialement structurés basés sur l'AAIE d'hydrogélateurs comme des peptides, l'AAIE prenant place dans un gel hôte et conduisant un a réseau supramoléculaire interpénétré au gel hôte. De plus notre objectif est de localiser le processus d'auto-assemblage en distribuant les enzymes de manière prédéfinie dans le gel hôte. Cela se fera par impression 3D ou en initiant le réseau supramoléculaire à la surface de particules enfouies dans le gel hôte. Ces deux techniques d'AAIE permettront de générer des gradients de réseaux supramoléculaires présentant des longueurs caractéristiques pouvant varier du centimètre à la centaine de microns. La présence d'un réseau dans un gel hôte devrait également modifier les propriétés mécaniques de l'ensemble du gel. Or, le module de Young constitue un paramètre important pour l'adhésion cellulaire et le devenir des cellules souches. Ces deux aspects seront abordés laissant entrevoir d'intéressantes applications en ingénierie tissulaire. En nous basant sur notre expérience et sur nos récents développements d'AAIE localisée près de surfaces sous l'action de l'alkaline phosphatase, nous utiliserons cette enzyme pour localiser l'auto-assemblage de peptides dans les gels hôtes. Nous utiliserons hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC) fonctionnalisé avec des groupements silanol comme gel hôte. Ce gel a été sélectionné car il interagit très peu avec les cellules. Cela permettra d'induire les interactions avec les cellules spécifiquement par le biais du réseau supramoléculaire. De nouveaux types de gels HPMC incorporant de l'acide hyaluronique seront développés afin de les rendre dégradables, une propriété importante pour la culture cellulaire. Nous étudierons en particulier l'influence des gradients du réseau supramoléculaire sur la migration cellulaire et comment un tel réseau permettra de guider la différentiation de cellules souches. Le grand intérêt de nos gels c'est que leurs propriétés peuvent être facilement modulées dans l'espace et dans le temps par addition de peptides sur le gel hôte. Le projet EASA est basé sur la complémentarité de 3 groupes: l'un expert en chimie des surfaces et assemblage supramoleculaire (ICS UPR22-CNRS), le second qui a développé des gels (HPC) qui interagissent peu avec des cellules mais permettant leur survie sur de longues périodes (INSERM U1229) et le troisième qui a une longue expériences en biomatériaux et ingénierie tissulaire (INSERM U1121).