Etude de l’émergence de la résistance aux antibiotiques et de la diversification génétique chez les bactéries à l’échelle de cellules uniques. – UniBac

Nous avons utilisé la plateforme universelle développée, brevetée et publiée par le laboratoire de Charles Baroud qui permet de suivre la dynamique de croissance de milliers de colonies individuelles provenant de cellules uniques, qui sont séparées en gouttelettes microfluidiques à l'échelle du nanolitre. De cette manière, les descripteurs des paramètres de croissance (par exemple, le temps de latence, le taux de croissance maximal, la taille finale de la colonie, ...) peuvent être déterminés pour des milliers de colonies individuelles en parallèle et fournir ainsi une distribution des valeurs pour chaque condition.

Nous avons pu cribler dans ce système, 5 AB différents. L'analyse de ces données nous a permis de comparer la réponse des cellules individuelles à ces antibiotiques, qui ont des mécanismes d'action différents, et de relier cette réponse au mécanisme d'action des AB. Nous avons également pu comparer l'évolution de la morphologie des cellules sous l'action des différentes molécules, notamment comme signature du stress des AB. Grâce à un nouvel outil d'intelligence artificielle, nous avons pu identifier les changements de morphologie cellulaire dans les images (environ 200 000 images de gouttes individuelles), afin de les relier au mécanisme d'action des AB. En parallèle nous avons poursuivi la caractérisation moléculaire des différentes réponses aux stress AB, chez E. coli et V. cholerae, et fait plusieurs découvertes importantes sur leur impact sur la persistance des bactéries lors des traitements.

Le projet a déjà conduit à plusieurs publications. Nous avons identifié différents facteurs, tous liés à la machinerie de traduction et au maintien de l'homéostasie protéique, qui jouent un rôle important dans le phénotype de tolérance et de persistance aux aminoglycosides (AG). Nous avons également montré une interaction entre le quorum sensing et les AG qui suggère que le ciblage de la signalisation QS pourrait être une stratégie pour améliorer l'efficacité de ces AB chez V. cholerae. La validation de la plateforme, sa description détaillée ainsi que les premiers résultats sur le suivi lors de traitement à la ciprofloxacine ont été soumis pour publication.
Ce projet a permis de formaliser la collaboration entre nos deux équipes et a conduit à une nouvelle collaboration sur le rôle des vésicules membranaires dans la résistance aux ABs.

7 articles et des programmes informatique

La résistance aux antibiotiques est une menace majeure dans le monde qui requiert un fort investissement dans les études fondamentales. La résistance, ainsi que la tolérance transitoire (persistance) aux antibiotiques, impliquent un réseau de réponses au stress intracellulaire: comme la réponse stringente, la réponse SOS et la réponse au stress général régulée par RpoS. Il a été montré que ces réponses au stress sont induites par des doses d'antibiotiques (AB) inférieures à la concentration minimale inhibitrice (sub-CMI) et qu'elles peuvent accélérer l'acquisition de la résistance héréditaire à travers l’induction de la mutagenèse et du transfert horizontal de gènes. Bien que de faibles concentrations d'antibiotiques ne tuent pas les bactéries, elles peuvent avoir un impact majeur sur les populations bactériennes. En particulier, il a été démontré que des concentrations d'AB très faibles (cent fois inférieures à la CMI) peuvent entraîner des mutations et la sélection de cellules résistantes aux AB.
La plupart des études décrivant comment les bactéries deviennent résistantes ou persistantes sont basées sur des expériences portant sur des populations de cellules. De telles mesures donnent lieu à des moyennes pour l'ensemble de la population, mais elles ne peuvent pas fournir une répartition précise des réponses dans les cellules individuelles dans la population ni suivre l'évolution chronologique des individus dans la population. Toutefois, il existe de plus en plus de preuves que les cellules d'une population donnée peuvent déclencher des réponses très hétérogènes à un stress AB.
Ce projet vise à décrire précisément le devenir cellulaire individuel lors de la réponse aux faibles doses d'antibiotiques et à comprendre l'émergence de la résistance et persistance aux antibiotiques au niveau de la cellule unique. Nous proposons d'étudier le profil de l'induction de quatre réponses de stress: SOS, réponse stringente, réponse au stress général RpoS et réponse au stress oxydatif, lors d’un traitement par trois AB de différentes familles (fluoroquinolones, aminosides, ß-lactames). Pour cela, nous utiliserons une plate-forme microfluidique pour cultiver des bactéries tout en les soumettant à des contraintes AB contrôlées afin d'évaluer l'hétérogénéité et la croissance sur la puce. Nous allons entreprendre la description théorique de la dynamique de la croissance bactérienne lors du stress AB grâce à la modélisation mathématique reliant l'hétérogénéité à grande échelle à la variabilité à l'échelle des cellules individuelles. Nous allons ensuite isoler et extraire des cellules qui présentent une diversité phénotypique. Les statistiques à grande échelle nous permettront d'avoir accès à des événements rares. Les cellules extraites seront soumises à une analyse (NGS, dPCR) afin de détecter les transferts de gènes, les mutations ou les changements d'expression des protéines qui peuvent expliquer le comportement de ces cellules. Cela nécessitera d'abord le développement d'outils technologiques pour génotyper le petit nombre de cellules bactériennes qui peuvent être récupérées à partir de la puce. La deuxième étape consistera à explorer les différentes conditions qui conduisent à l'émergence de la résistance aux antibiotiques afin de mieux en comprendre les mécanismes et d'élaborer des stratégies pour les contrer.
L'impact de ce projet sera triple: (i) par les connaissances biologiques fondamentales qu'il apportera, (ii) par les développements technologiques et quantitatifs qui l'accompagnent, et (iii) par la compréhension de l'émergence des mécanismes de résistance et de leurs implications pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques