Déterminants de la progression du réplisome en présence d’obstacles – REPLIBLOCK

Notre projet se base largement sur l'utilisation d'une méthode appelé iPOND qui permet d'identifier de nouveaux acteurs du stress réplicatif. Pour cela nous capturons les protéines associées à la machinerie de réplication a l'aide d'un analogue de la thymidine (EdU) qui s’incorpore en lieu et place de la thymidine lors de la synthèse d'ADN. Les protéines associées à la machinerie de réplication sont ensuite analysées par spectrométrie de masse.

Nous avons sélectionné les candidats les plus intéressants par une approche orthogonal afin de les étudier plus profondément avec des méthodes telles que le peignage de l'ADN, l'immunofluorescence ou le Western-blot.

Nos expériences ont permis la caractérisation de deux acteurs important de la réponse au stress réplicatif

1. RIF: un acteur clé de l'organisation de la réplication

Nous montrons que RIF1 est nécessaire au maintien de la structure de la réplication en présence de stress réplicatif en facilitant notamment le recrutement des cohésines. En l’absence de RIF1, l’intégrité de ces structures est perdue et des lésions de l’ADN pouvant conduire à des réarrangements de génome apparaissent. Nous proposons que RIF1 soit capable de protéger les foyers de réplication en présence de stress réplicatif pour prévenir l’apparition de lésions de l’ADN. Ces résulats ont été publiés dans la revue Life Science Alliance en 2023 (DOI: 10.26508/lsa.202101186)

2. GNL3 régule les origines de réplication et protège les fourches de réplication

Nous avons identifié GNL3 comme un nouveau composant du réplisome qui limite l’activation des origines de réplication. L’absence de GNL3 conduit à une résection exacerbée des brins naissants en présence de stress réplicatif due à l’épuisement du complexe RPA du fait de l’activation excessive des origines de réplication. Nous montrons par différentes approches que GNL3 interagit avec ORC2 dans le nucléole. Nous proposons que GNL3 limite l’activation excessive des origines de réplication en séquestrant une partie du pool d’ORC2 dans le nucléole. Ces résultats ont été publiés dans la revue EMBO Reports en 2023 (DOI: 10.15252/embr.202357585)

Nos résultats conduisent à deux nouvelles thématiques de recherche pour notre laboratoire :

1. La protéine GNL3 que nous avons identifiée est fortement induite dans beaucoup de cancers. Des résultats de la littérature indiquent qu'elle serait nécessaire à la multiplication des cellules cancéreuses. Nos futurs travaux vont s'attacher à comprendre son rôle exact dans le cancer et vont déterminer s'il elle constitue une cible thérapeutique potentielle.

2. Le génome humain est composé de plus de 3 milliards de nucléotides. Néanmoins sa structure n'est pas homogène et certaines régions qui forment par exemple des structures particulières (palindromes) ou des répétitions sont plus difficiles à répliquer. Nous allons essayer de mieux comprendre comment s'effectue la réplication de ces régions. Premièrement, nous allons analyser si des protéines spécifiques sont nécessaires à la réplication de ces régions particulières du génome. Deuxièmement, nous allons utiliser des approches de séquençage haut-débit pour déterminer quelles sont les régions du génome qui posent problème à la machinerie de réplication dans différents contextes.

La duplication du génome entier est un processus colossal qui nécessite d’être parfaitement contrôlé pour éviter la propagation de mutations ou de réarrangements aux cellules filles. Néanmoins, la route du réplisome, la machinerie protéique nécessaire pour copier l’ADN, est semée d’obstacles qui perturbent sa progression et conduisent à l’augmentation du stress réplicatif. Les sources de stress réplicatif peuvent d’être d’origine endogène, telles que des régions remarquables (répétitions en tandem, gènes hautement transcrits, quadruplexes de guanines, contraintes topologiques…) ou des molécules issues du métabolisme (formaldéhyde, dérivés réactifs de l’oxygène…). De plus des agents exogènes d’origine naturelle (ultraviolets, rayons gamma…) ou non (pollution, fumée de cigarette, traitements de chimiothérapie…) perturbent aussi la progression des fourches. Les cellules possèdent une pléthore de mécanismes pour stabiliser et traiter les fourches bloquées afin d’empêcher leur conversion en lésions de l’ADN. Néanmoins plusieurs questions restent sans réponse comme la nature exacte et la dynamique des protéines recrutées ou les mécanismes de recrutement de ces dernières.

L’objectif principal du projet est d’explorer les mécanismes permettant aux cellules eucaryotes de répondre aux blocages des fourches de réplication. Notre hypothèse principale est que les protéines recrutées ou enlevées du réplisome en réponse à des molécules qui augmentent le stress réplicatif devraient être des déterminants majeurs de la réponse aux fourches bloquées. L’analyse systématique des protéines recrutées aux fourches bloquées était quasi impossible auparavant. Néanmoins la possibilité de purifier la chromatine naissante rend possible ce projet. Nous avons mis en place la méthode iPOND (isolation of proteins on nascent DNA) couplée à la spectrométrie de masse (iPOND-MS). Grace à cette méthode nous sommes capables d’analyser les protéines recrutées aux fourches de réplication dans des conditions normales et en présence de stress réplicatif induit par des molécules exogènes.

Nous proposons d’utiliser la méthode iPOND-MS afin d’étudier systématiquement la dynamique de recrutement de protéines en réponse à un panel de molécules qui bloquent les fourches de réplication. Nous testerons des inhibiteurs de la réplication, des agents endommageant l’ADN, des inhibiteurs de topoisomérases, des inhibiteurs spécifiques et des ligands des quadruplexes de guanines. L’utilisation de molécules ayant des mécanismes d’action très différents devrait permettre de mettre à jour une grande variété de protéines. Cette première étape devrait conduire à une liste de candidats que nous valideront en utilisant une approche orthogonal de microscopie à haut-débit (Celigo). Les rôles des protéines identifiées dans la réponse au stress réplicatif seront étudiés par des méthodes telles que le peignage de l’ADN ou l’iPOND couplées à des approches innovantes comme la dégradation inductible de protéines (degron) ou la méthode CRISPR-Cas9.

Nous sommes convaincus que notre approche conduira à la découverte de nouveaux acteurs de la réponse des fourches de réplication au stress réplicatif. Néanmoins, si nous devions échouer dans la découverte de nouvelles protéines nous étudierons de manière approfondie BAZ1B (un régulateur de la topoisomérase 1 durant la réplication) et RIF1 (une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN, la réplication et la protection de télomères), deux protéines que nous récemment identifiées en utilisant l’iPOND-MS.

Ce projet devrait avoir des retombées en science fondamentale en augmentant nos connaissances sur les mécanismes de réplication de l’ADN mais aussi en termes de santé publique. En effet les protéines identifiées comme facteurs clés de la réponse aux fourches de réplication pourront être validés par la suite comme des biomarqueurs du vieillissement ou de l’exposition à des agents endommagent l’ADN présents dans l’environnement.