Dissection des mécanismes moléculaires de la régulation traductionnelle par une nouvelle approche microfluidique – RiboFluidiX

Les processus biologiques fondamentaux nécessitent une adaptation du métabolisme principalement par la régulation de la traduction afin de répondre à divers stimuli tels que des changements environnementaux, des réponses au stress ou des infections virales. Ces processus sophistiqués sont le résultat de l'interaction entre de nombreux acteurs: les ribosomes, les éléments en cis situés dans l'ARN ribosomique ou dans l'ARNm (les régulons) et les facteurs agissant en trans tels que les facteurs d'initiation de traduction. En raison de cette complexité, l’étude de ces mécanismes par des approches in vivo est très difficile. Pour cette raison, la mise au point d’approches in vitro simplifiées qui facilitent l’interprétation d’expériences de ce type d’études est très demandée. C’est précisément l'objectif de cette proposition qui permettra de développer une méthode in vitro innovante et inédite. Nous utiliserons une nouvelle approche microfluidique combinant l'utilisation d'ARNm rapporteurs fluorescents, des extraits de traduction acellulaires et le séquençage à haut débit. Cette méthode permettra de trier rapidement par fluorescence des variants d'ARNm actifs et inactifs à partir de grandes banques. Nous déchiffrerons les mécanismes moléculaires de nombreux processus de régulation de la traduction d'une manière rapide, systématique et globale. Notre consortium est composé de deux partenaires, Franck Martin (coordinateur) expert en traduction et Michael Ryckelynck, expert en microfluidique. Plusieurs expériences séminales de preuve de concept ont déjà été réalisées. Nous avons étudié exhaustivement les règles de décodage de la traduction eucaryote. Ainsi nous avons déterminé toutes les combinaisons codon-anticodon qui sont acceptées par le ribosome. Cette preuve de concept a conduit à la découverte d'aspects fondamentaux remarquables de la traduction eucaryote, par exemple, les anticodons GGN sont préjudiciables à la fidélité de décodage. Fait intéressant, l'analyse phylogénétique a montré que ces anticodons n'existent pas chez les eucaryotes, ils auraient été perdus au cours de l'évolution en raison des problèmes de fidélité de la traduction que nous avons prédits par nos sélections. Ce résultat remarquable a confirmé que notre approche microfluidique est un nouvel outil puissant conduisant à des découvertes fondamentales dans le domaine de la traduction. Notre projet sera d’exploiter cette nouvelle technique pour étudier d'autres questions fondamentales dans la traduction eucaryote comme la sélection du codon de démarrage de la traduction. Grâce à notre approche microfluidique, nous déterminerons les séquences entourant le codon de démarrage optimales ainsi que l'impact de facteurs agissant en trans (par exemple eIF5). Puis, nous étudierons la traduction non-AUG et déterminerons exhaustivement tous les codons alternatifs qui peuvent initier la traduction avec le ribosome eucaryote. Nous développerons cette approche pour aborder d'autres questions spécifiques dans le domaine du contrôle de la traduction. Le but sera de caractériser de nouveaux régulons d'ARN qui modulent la traduction eucaryote. Cela nécessitera des développements techniques afin d'effectuer des sélections positives et négatives. Nous criblerons de grandes bibliothèques d'ARN afin de caractériser de nouveaux régulons d'ARN tels que les IRES, des éléments inhibiteurs ou stimulateurs de la traduction. Nous nous concentrerons sur deux ARN génomiques viraux, la dengue et Sindbis. Ensuite, nous utiliserons la même stratégie pour identifier de nouveaux régulons d'ARN dans le génome humain en criblant des banques d’UTR. La dernière partie de ce projet sera d'étendre notre nouvelle approche microfluidique à la traduction procaryote. Le but ultime sera de développer un protocole efficace pour la sélection de médicaments pour des inhibiteurs spécifiques conduisant à la découverte d'antibiotiques, un problème majeur pour la santé humaine dans les années à venir.