Marquage des récepteurs endogènes dirigé par des ligands: application à l'étude des hétéromères D1-mGlu5 dans des neurones. – LANTHSLIDER

Ce projet permettra de lier de manière covalente une étiquette fluorescente à des récepteurs endogènes, dans leurs tissus natifs. Notre stratégie repose sur la synthèse d’un complexe composé d’un ligand spécifique du récepteur (qui sert d’appât), fusionné à un fluorophore (Lanthanide) par l‘intermédiaire d’un bras qui réagit avec les résidus nucléophiliques naturels à proximité de la poche de liaison du ligand. La liaison covalente effective (récepteur étiqueté) induit le clivage du ligand qui est alors libéré de la poche de liaison du récepteur. Ces récepteurs étiquetés sont fonctionnels et peuvent être activés ou inhibés comme n’importe quel récepteur endogène. Nous pourrons suivre au cours du temps l’expression, le devenir et les interactions des récepteurs endogènes dans leur contexte natif. Cette approche non-invasive présente de multiples avantages : D’abord, l’utilisation de la pharmacologie pour cibler l’étiquetage d’un récepteur d’intérêt représente une avancée notable pour tous les récepteurs difficiles à étudier par manque d’anticorps spécifiques. La liaison covalente du fluorophore permettra une étude à long terme du comportement du récepteur dans les cellules vivantes. Deuxièmement, l’absence de clonage moléculaire pour ajouter un fluorophore permettra d’étudier les interactions de ce récepteur par FRET en s’affranchissant de modifications artificielles de la séquence du récepteur. Et troisièmement, puisqu’il s’agit d’études de récepteurs endogènes, par définition le niveau d’expression des récepteurs n’est pas expérimentalement modifié, ce qui est primordial pour la pertinence des études fonctionnelles d’interactions protéiques. Nous pourrons ainsi comparer l’expression de récepteurs et leur dimérisation dans des conditions naturelles, soit physiologiques soit pathologiques. Le programme Lanthslider comporte 3 taches : 1) La synthèse d’une série d’antagonistes étiquetés avec des fluorophores reliés par des bras de natures différentes; 2) L’évaluation de l’efficacité de la réaction de liaison du fluorophore au récepteur sur des systèmes modèles, incluant des récepteurs recombinants étiquetés ; 3) Le marquage des récepteurs exprimés de manière endogène dans les neurones et le suivi de la dynamique et de la fonction de leur dimérisation. Pour résumer, ces outils permettront pour la première fois d’étudier l’expression de récepteurs endogènes, leur stabilité et leurs propriétés de recyclage mais aussi l’existence et le rôle de dimérisations endogenes dans des conditions physiologiques ou pathologiques. A titre d’exemple, nous caractériserons les associations entre récepteurs endogènes de la dopamine et du glutamate (mGlu5-D1) leur dynamique et leur rôle dans le contexte de la progression de la maladie de Parkinson.